細胞冷凍保存方法?步驟與注意事項

來源：上海撫生實業有限公司 2024年10月21日 16:10

冷凍保存方法：

1、傳統方法: 冷存管置于4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-80℃16～18小時(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長期儲存。

-20℃不可超過1小時，以防止胞內冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

2、程序降溫：利用已設定程序的等速降溫機以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。

3、步驟：

（1）冷凍前24-48小時更換半量或全量培養基，使細胞處于指數生長期。

（2）配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養基、血清，逐滴加入二甲基亞砜（DMSO）至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。

（3）離心收集培養之細胞，用加血清的培養基重懸起細胞，取少量細胞懸浮液(約0.1ml)計數細胞濃度及凍前存活率。

（4）取與細胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細胞懸液，并晃動試管，制成細胞凍存懸液（DMSO最后濃度為5～10％），使細胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標示全之冷凍保存管中，1～2ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。嚴密封口后，注明細胞名稱、代數、日期。然后進行凍存。

注意事項：

（1）欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態，約為80～90％致密度。冷凍前檢測細胞是否仍保有其te有性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。

（2）細胞在液氮中可長期凍存無限shi間，而不會影響細胞活力；在-70度可保存數月。

（3）注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色(以0.22micron　FGLP　Telflon過濾或是直接購買無菌產品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液，可避免DMSO直接加入時釋放的熱量對細胞的損傷。緩慢逐滴加入細胞懸液是使細胞逐步適應高滲，可降低細胞受損。DMSO可能引起部分白血病細胞株的分化，可換用10%甘油凍存。

（4）冷凍保存之細胞濃度：

①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml

②hybridoma:1～3×106cells/ml，細胞濃度不要太高，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后死qu。

③adherent tumor lines:5～7×106，依細胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1～3×106cells/ml

④other suspensions:5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml。

（5）冷凍保護劑濃度為5或10％DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。

（6）、凍存可用10%～90%的血清，一般高濃度血清有助于維護細胞活力，此處介紹20%終濃度有利于細胞懸浮而少沉積（4度時），復蘇存活率在80%～90%以上，對原代培養細胞，以90%血清凍存更為有效。

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