大腸桿菌感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化中的影響因素有哪些？

1. 細胞的生長狀態(tài)和密度
最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。細胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細胞數(shù)在5×107個左右為佳。即應(yīng)用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細菌可通過測定培養(yǎng)液的OD600控制。對TG1菌株OD600為0.5時細胞密度在5×107個/ml左右。(應(yīng)注意OD600值與細胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同)。密度過高或不足均會使轉(zhuǎn)化率下降。此外受體細胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時，可加入占總體積10%-15%的無菌甘油或-70℃保存
2. 質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度
用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時，則會使轉(zhuǎn)化率下降。一般地，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細胞體積的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受態(tài)細胞達到飽和。對于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，實驗證明，大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進行轉(zhuǎn)化。此外，重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10~100倍，因此重組DNA大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子。
3. 試劑的質(zhì)量
所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于4℃。
4. 防止雜菌和雜DNA的污染
整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管、移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。
5. 整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉(zhuǎn)化率將會降低。
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