關(guān)于固相多肽合成這些雷你都避開了嗎？

 

這類雜質(zhì)源于在氨基酸上接入Fmoc基團(tuán)的試劑和已經(jīng)成形的Fmoc-氨基酸發(fā)生副反應(yīng)。二肽雜質(zhì)存在會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)氨基酸重復(fù)插接。

圖2 二肽雜質(zhì)

β-丙氨酰類雜質(zhì)

游離氨基酸源于氨基酸與Fmoc試劑的不反應(yīng)。游離氨基酸存在會(huì)導(dǎo)致多個(gè)目標(biāo)氨基酸重復(fù)插接肽鏈，導(dǎo)致Fmoc基團(tuán)在Fmoc-氨基酸衍生物儲(chǔ)存過程中自動(dòng)催化裂解。

毫無疑問，這些雜質(zhì)都會(huì)大大降低固相多肽合成的產(chǎn)率和純度，增大提純難度。

多肽合成中的“隱藏殺手"：乙酸

相比于氨基酸骨架的雜質(zhì)，乙酸則更像是固相多肽合成的“天敵"。由于分子量小且也會(huì)被活化劑活化，具有高反應(yīng)活性，即便痕量乙酸也會(huì)在固相合成過程中截?cái)嘌由斓碾逆湣?/section>

有很多人覺得一點(diǎn)點(diǎn)乙酸，無關(guān)緊要。那咱們來做個(gè)數(shù)學(xué)題：

Fmoc-Arg(Pbf)-OH受到低至0.1%的乙酸污染，就相當(dāng)于1mol%的乙酸污染。但如果考慮到通常試劑用量會(huì)超出5倍，而高反應(yīng)活性乙酸會(huì)先于氨基酸與肽段結(jié)合，則每次循環(huán)會(huì)造成高達(dá)5%的鏈終止。如果合成的多肽含有3%的殘基，則意味著15%的鏈會(huì)終止。

圖4 乙酸對(duì)合成多肽的影響

下圖是實(shí)例展示。僅僅0.1%的乙酸污染對(duì)于21 mer多肽合成的影響；截?cái)嗟母碑a(chǎn)物采用“*"表示。

圖5 含有乙酸合成多肽的HPLC譜圖

Fmoc-氨基酸中的乙酸很難檢測(cè)，默克專門開發(fā)了標(biāo)準(zhǔn)Fmoc-氨基酸中乙酸定量的方法。

跟所有工業(yè)產(chǎn)品一樣，氨基酸原料的純度也存在批次差異。這里有個(gè)規(guī)律，純度越高，差異性就越小。

多肽批次間差異

談完原料，可以說說多肽了。

序列相同的多肽，不同批次間存在差異，這個(gè)無法避免。序列不同的多肽，本身的性質(zhì)也有差異，比如聚集 – 疏水性多肽的濃度越高，聚集也越高，活性主要取決于聚集形態(tài)下的活性。

此外，穩(wěn)定性也很重要。多肽在儲(chǔ)存過程中會(huì)有化學(xué)轉(zhuǎn)變。比如含有Asp-Gly的多肽導(dǎo)致形成iso-Asp，多肽中的Cys通過形成二硫鍵而交聯(lián)以及Met氧化成亞砜和焦形成。這些雜質(zhì)有可能帶有細(xì)胞毒性，比如二硫蘇糖醇（DTT）。

除了純度之外，多肽的穩(wěn)定性跟儲(chǔ)存有關(guān)，凍干狀態(tài)常比溶液更穩(wěn)定；再一個(gè)影響穩(wěn)定性的因素就是氨基酸組成和序列，所謂sequence depends！

下面是幾個(gè)典型的組成和序列導(dǎo)致的穩(wěn)定性降低。

氧化：Cys (C)和Met (M)殘基是發(fā)生可逆氧化的主要氨基酸。殘基發(fā)生氧化后形成亞砜和/或砜，很難逆轉(zhuǎn)。

二酮和焦形成：二酮形成通常發(fā)生在(G)位于N末端第3位點(diǎn)時(shí)，Pro (P)或Gly (G)位于第1或第2位點(diǎn)時(shí)更易發(fā)生。如果Gln (Q)位于序列的N末端位點(diǎn)，則焦形成幾乎是不可避免的。這種轉(zhuǎn)變也可能發(fā)生在N末端位點(diǎn)含有Asn (N)的多肽序列中，但可能性較小。

歸根到底，想要高質(zhì)量的多肽產(chǎn)品，就一定需要高品質(zhì)的原料和試劑。