分子雜交探針種類及選擇

　探針的概念
　　放射性同位素、*或熒光染料進行標(biāo)記的已知序列的核酸片段，即為探針（probe）。探針可用于分子雜交，雜交后通過放射自顯影、熒光檢測或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來。

　　探針的種類極其選擇

　　基因探針根據(jù)標(biāo)記物不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類；根據(jù)探針的來源及核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，及寡核苷酸探針等幾類。

　　1、DNA探針
　　DNA探針是Z常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針。現(xiàn)已獲得DNA探針數(shù)量很多，有細菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。

　　DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細菌的分類和菌種鑒定比之G + C百分比值要準(zhǔn)確的多，是細菌分類學(xué)的一個發(fā)展方向。加之分子雜交技術(shù)的高敏感性，分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景。

　　DNA探針（包括cDNA探針）的優(yōu)點：
　　①這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。
　　②不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。
　　③DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機引物法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。

　　２、cDNA 探針
　　cDNA （complementary DNA）探針是指互補于mRNA的DNA分子，是由逆轉(zhuǎn)錄酶催化而產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA（其中U與A配對）。 cDNA 探針是目前應(yīng)用Z為廣泛的一種探針。

　　3、RNA探針：
　　RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率*。早期采用的RNA探針是細胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過程中得到標(biāo)記的，標(biāo)記效率往往不高，且受到多種因素的制約。這類RNA探針主要用于研究目的，而不是用于檢測。

　　克隆探針：
　　前述三種探針均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。在DNA序列未知而必須首*行克隆以便繪制酶譜和測序時，也常應(yīng)用克隆。
克隆探針的優(yōu)點：[1]特異性強，從統(tǒng)計學(xué)角度而言， 較長的序列復(fù)雜度高，隨機碰撞互補序列的機會較短序列少；[2]可獲得較強的雜交信號，因為克隆探針較寡核苷酸探針摻入的可檢測標(biāo)記基團更多。

　　4、寡核酸探針：
　　根據(jù)已知的核酸序列，采用DNA合成儀合成一定長度的寡核苷酸片段，亦可作為探針使用。若不知核酸序列，可根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序推倒出核酸順序，但要考慮到密碼子的兼并性。多用于克隆篩選和點突變分析。

　　人工合成的寡核酸探針有下述優(yōu)點：
　　①短的探針比長探針雜交速度快，特異性。
　　②可以在短時間內(nèi)大量制備。
　　③在合成中進行標(biāo)記制成探針。
　　④可合成單鏈探針，避免了用雙鏈DNA探針在雜交中自我復(fù)性，提高雜交效率。
　　⑤寡核苷酸探針可以檢測小DNA段，在嚴(yán)格的雜交條件下，可用于檢測在序列中單堿基對的錯配。

　　篩選寡核苷酸針的原則 ：
　　①長18～50bp，較長探針雜交時間較長合成量低；較短探針特異性會差些。
　　②堿基成分：G+C含量為40%～60%，超出此范圍則會增加非特異雜交。
　　③探針分子內(nèi)不應(yīng)存在互補區(qū)，否則會出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。
　　④避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)（不能多于4個），如-CCCCC-。
　　⑤一旦選定某一序更符合上述標(biāo)準(zhǔn)，將序列與核酸庫中核酸序列比較，探針序列應(yīng)與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不能超過70%或有連續(xù)8個或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。

主營產(chǎn)品：顯微鏡、分子雜交儀（爐）、紫外交聯(lián)儀、超聲波細胞破碎儀、水浴氮吹儀、氮吹儀