藍景科信DAP-seq（DNA親和純化測序）實驗流程

來源：藍景科信河北生物科技有限公司 2021年04月01日 17:37

一、蛋白表達載體構建

1.1. 蛋白表達載體構建試劑

高保真PCR預混液，瓊脂糖凝膠回收試劑盒，同源重組克隆試劑盒，DH5α感受態細胞，高純度質粒小提試劑盒。

1.2. 蛋白表達載體構建方法

1.2.1. 根據基因CDS序列，設計上游和下游引物并進行引物合成。

1.2.2. 使用高純度質粒小提試劑盒提取含有CDS序列的質粒模板，或者使用客戶提供的質粒模板，對目的CDS進行PCR擴增。

1.2.3. PCR反應程序

1.2.4. PCR產物回收
PCR結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳。使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒，對目的條帶進行膠回收。PCR產物回收后，測定回收產物的濃度，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
1.2.5. PCR產物與蛋白表達載體的連接轉化與鑒定
使用同源重組方法，將目的片段與蛋白表達載體進行連接。將連接產物轉化到DH5α感受態細胞中，涂布于含有抗生素的LB培養基上，倒置培養。挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，對擴增出目的條帶的菌落進行質粒提取與測序。將測序結果與CDS進行序列比對。
1.2.6. 蛋白表達載體的質粒提取
對構建正確的蛋白表達載體，進行質粒的提取，為后續蛋白表達做準備。

二、基因組DNA的提取
2.1. 基因組DNA提取試劑
根據不同物種、組織和器官，使用相應的提取試劑或者試劑盒。例如：CTAB提取試劑盒、植物通用型提取試劑盒、磁珠法提取試劑盒、含多糖多酚樣本的基因組DNA提取試劑盒。
2.2. 基因組DNA提取方法
2.2.1. 稱取適量樣本材料，液氮速凍，研磨成粉末，使用相應的試劑盒進行基因組DNA提取。
2.2.2. 對提取的基因組DNA的質量進行檢測，包括基因組DNA濃度，純度，電泳。

三、親和純化文庫構建
3.1. 親和純化文庫構建試劑
3.1.1. DNA建庫試劑盒（BIOO SCIENTIFIC，NOVA-5188-01-NEXTflex-Rapid-DNA-Seq-kit-2.0）。
3.1.2. DNA Clean Beads （MICH Scientific，貨號NGS-0201-100）
3.2. 親和純化文庫構建方法
3.2.1. 取適量基因組DNA進行片段化。
3.2.2. 對片段化后的基因組DNA進行篩選。
3.2.3. 取適量片段篩選后的基因組DNA進行親和純化文庫的構建，具體方法詳見NOVA-5188-01-NEXTflex-Rapid-DNA-Seq-kit-2.0建庫試劑盒說明書（BIOO SCIENTIFIC）。
3.2.4. 文庫構建結束后進行質檢。

四、體外無細胞蛋白表達與檢測
4.1. 體外無細胞蛋白表達的主要試劑
4.1.1. 無細胞蛋白表達試劑盒
4.1.2. 用于進行Western Blot檢測的一抗和二抗。
4.2. 體外無細胞蛋白表達反應方法
根據無細胞蛋白表達試劑盒的使用說明，建立以下反應體系，然后25 °C孵育2 h。

4.3. 體外蛋白表達檢測

4.3.1. 體外蛋白表達結束后，取適量反應液，進行SDS PAGE和Western Blot，檢測有無目標蛋白的特異性條帶。

五、蛋白質與文庫的親和純化

5.1. 親和純化所需要的主要試劑和設備

5.1.1. 親和純化磁珠

5.1.2. 平衡緩沖液

5.1.3. 24孔磁力架（Mich Scientific，貨號Magpow-24）

5.2. 親和純化方法

5.2.1. 將平衡好的磁珠與平衡緩沖液混勻。

5.2.2. 將蛋白表達預混液與磁珠充分混勻后進行孵育。

5.2.3. 向上述混合液中加入適量文庫后充分混勻后進行孵育。

5.2.4. 洗滌非特異性結合DNA，洗脫特異性結合的DNA。

六、洗脫文庫擴增質檢與測序

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