PCR分子克隆實(shí)驗(yàn)引物溶解稀釋方法熒光定量PCR儀

在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分子克隆實(shí)驗(yàn)時(shí)，經(jīng)常需要合成大量的引物，而這些合成的引物首先要進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尣拍苁褂谩Ｈ绻幌♂尵褪褂靡铮斐梢锏睦速M(fèi)和過早的活性喪失，更有一些被污染而不能使用。

因此，建議對(duì)合成的引物*行稀釋，然后使用。稀釋的引物利于保存和應(yīng)用。

現(xiàn)將方法簡(jiǎn)單敘述如下：

1. Oligo DNA是以O(shè)D260單位來計(jì)算的，這是指在1ml體積1cm光程標(biāo)準(zhǔn)比色皿中，260nm波長(zhǎng)下吸光度為1A260的Oligo溶液定義為1 OD260單位，根據(jù)此定義，1 OD260單位相當(dāng)于33μg的Oligo DNA，您可以根據(jù)此數(shù)據(jù)和您的Oligo DNA分子量，計(jì)算得到摩爾數(shù)以計(jì)算不同摩爾濃度的溶液。

2. 引物序列的分子量計(jì)算公式如下：

MW=（A堿基數(shù)×312）+（C堿基數(shù)×288）+（G堿基數(shù)×328）+（T堿基數(shù)×303）-61

例如：引物TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG   A=1  C=3  G=11  T=6

MW=（1×312）+（3×328）+（6×303）-61=6541

3. Oligo DNA的分子量也可以用以下近似方法計(jì)算：Oligo DNA中的每個(gè)脫氧核苷酸堿基的平均分子量近似為324.5，則一條Oligo DNA的分子量=堿基數(shù)×324.5。

例：

您得到一管標(biāo)為5 OD260的20 mer Oligo DNA

分子量=20×324.5=6490

質(zhì)量數(shù)=5×33=165μg

摩爾數(shù)=165/6490=0.025μmol=25nmol

若加滅菌雙蒸水400μl溶解，則濃度為25nmol/400μl=62.5μM

4. 裝有引物的eppendorf管一般保存于-20℃，臨用前稀釋。

5. 由于Oligo DNA呈很輕的干膜狀附在管壁上，打開時(shí)極易散失，所以打開管子前請(qǐng)先離心10,000rpm,1min,然后再慢慢打開管蓋。

6. 在裝有引物的eppendorf管內(nèi)加入100-500μl雙蒸水，蓋上管蓋，充分上下振蕩5-10分鐘，再次離心10,000rpm,1min。

7. 計(jì)算原引物管primer的濃度（必要時(shí)測(cè)OD260核對(duì)廠家提供引物量是否正確）。

8. 計(jì)算并將應(yīng)用primer稀釋為10pmol/μl。

9. 標(biāo)明原引物管、應(yīng)用引物管、稀釋方法，置-20℃保存。