南京信帆生物：5羥甲基化研究背景及與疾病的關系

5hmC- 哺乳動物DNA中的“第六堿基”

早在上世紀70年代，Penn等人發現在哺乳動物DNA中存在5-羥甲基化胞嘧啶（5hmC）(Penn et al., 1972)。然而該發現并未得到反復證實(Kothari and Shankar, 1976)，因而5hmC也沒有受到應有的重視。直到2009年，Kriaucionis 和Tahiliani兩位科學家證實小鼠的Purkinje細胞，顆粒神經元以及胚胎干細胞存在5hmC (Kriaucionis and Heintz, 2009; Tahiliani et al., 2009)。此外，在哺乳動物的其他組織中同樣檢測到大量5hmC的存在 (Globisch et al., 2010)。其中5hmC在中樞神經和脊髓中含量zui高(0.3-0.7%)，在腎臟、鼻上皮細胞、膀胱、心臟、骨骼肌和肺部的含量居中(0.15 -0.17%)，而肝臟、脾臟和內分泌腺中的含量zui低(0.03-0.06%)。宋紅軍等人利用敏感度更高的5hmC化學標記法對HeLa和HEK293細胞檢測發現，5hmC大約占總核苷酸的0.001% (Song et al., 2011)。

5甲基胞嘧啶轉變為5羥甲基胞嘧啶的途徑

DNA氧化損傷能產生各種修飾堿基，如*可被氧化成為8-氧橋*，5甲基胞嘧啶可被氧化生成5羥甲基胞嘧啶。因此，某些細胞中的5hmC很可能就是環境氧化壓力所造成的。但是Kriaucionis和Heintz的發現表明5hmC的存在并未伴隨有其他損傷產物的積累，并且Purkinje細胞和顆粒細胞中的5hmC總量與小鼠的年齡也不存在必然的(Kriaucionis and Heintz, 2009)。新近發現的TET蛋白家族使人們對5hmC有了更深入的了解：TET是一種能夠催化5甲基胞嘧啶產生5羥甲基胞嘧啶的加氧酶。TET蛋白家族有3個成員，分別是Tet1，Tet2和Tet3。它們都含有一個序列保守的C-端催化結構域 (Ito et al., 2010; Tahiliani et al., 2009)，并具有2-氧化戊二酸和2價鐵原子依賴型雙加氧酶的典型特征(Aravind and Koonin, 2001; Loenarz and Schofield, 2009)。

*圖釋：哺乳動物DNA中的胞嘧啶種類。胞嘧啶是DNA復制的原料之一；5甲基胞嘧啶則是DNA甲基化轉移酶DNMT以S-腺苷*(SAM)為甲基供體催化胞嘧啶形成的；5羥甲基胞嘧啶是在TET蛋白作用下形成的，TET利用氧分子使羥基轉移到5甲基胞嘧啶上。

5hmC的生物學作用

5hmC可影響長期和短期的基因表達調控，因此在體內可能具有重要的生物學意義。由于維持性甲基化酶DNMT1不能識別羥甲基化胞嘧啶，甲基化胞嘧啶所轉化的羥甲基胞嘧啶可能有助于DNA進行被動去甲基化。維持性甲基化的保真度即使只發生微弱的降低就足以導致多次細胞分裂的過程中CpG的甲基化水平呈指數級降低，從而實現被動性去甲基化。

*圖釋：5hmC 可能的生物學功能： DNA甲基轉移酶（DNMT）無法識別5hmC，因而5hmC在DNA復制過程中可以阻礙DNMT的維持性甲基化作用，zui終導致DNA的被動去甲基化。

在光氧化實驗或高pH條件下，5羥甲基胞嘧啶可通過去醛基產生胞嘧啶 (Privat and Sowers, 1996，Alegria, 1967; Flaks and Cohen, 1959)，這使得在特定細胞環境中5羥甲基胞嘧啶有可能轉變為胞嘧啶。一種可能性就是5羥甲基胞嘧啶作為主動去甲基化途徑中的一個關鍵中間體存在，而這種去甲基化途徑通常涉及到DNA的損傷修復機制(Tahiliani et al., 2009)。這種觀點也得到了一些證據的支持：早在1988年，cannon等人就報道了牛胸腺提取物存在特異修飾5hmC的糖基化酶(Cannon et al., 1988)。此外，還有報道表明一些DNA糖基化酶如TDG和MBD4參與了DNA去甲基化過程，但目前體外酶活性試驗尚未證實這些酶具有催化甲基胞嘧啶的活性。除此之外，hmC可以通過脫氨基作用生產去甲基化過程的中間產物hmU。因為在成纖維細胞中已經檢測到了高活性的hmU:G的糖基化酶(Rusmintratip and Sowers, 2000)。

*圖釋：5hmC可能的生物學作用-5hmC可以被DNA修復酶識別，例如5hmC特異DNA糖基化酶(5hmC-DG)可以把羥甲基胞嘧啶轉變為胞嘧啶，從而引起DNA的主動性去甲基化

作為一個潛在穩定的堿基，5hmC也有可能通過募集5hmC結合蛋白或者排斥甲基化結合蛋白（MBPs）來影響染色質結構和轉錄活性。而實驗結果也確實證明了甲基化結合蛋白MeCP2無法識別5hmC (Valinluck et al., 2004)。

*圖釋：5hmC可能生物學作用- 由于5hmC不能被甲基化結合蛋白（MBD1，MBD2，MBD4，MeCP2）所識別，這樣羥甲基化修飾的DNA就不能募集組蛋白去乙?；福瑥亩梢孕纬删哂修D錄活性的染色質結構。

5hmC在基因組的分布以及與基因表達水平的關系

基因體（gene body）上的5hmC及其與基因表達水平的關系

大量研究表明，5hmC特異性地富集在基因體上(Jin et al., 2011; Pastor et al., 2011; Song et al., 2011; Xu et al., 2011)。進一步深入的研究發現基因內部的5hmC含量往往可以表征基因表達的活性，這也與以前報道5hmC能夠促進或維持基因表達的結論一致(Jin et al., 2011; Song et al., 2011)。在一些沒有發生實質性去甲基化（5mC轉變為5C）的過程中，5mC轉換成5hmC可能是起到類似DNA去甲基化的作用，即可以解除5mC對基因表達的抑制效應(Wu and Zhang, 2010)。然而，基因體5hmC的水平與基因表達高低也不是簡單的線性關系，Xu等人發現在組成型表達的基因如看家基因的基因體上5hmC含量很低。

啟動子區的5hmC及其與基因表達水平的關系

Song等人觀察到5hmC主要富集在如轉錄起始位點，轉錄終止位點和基因遠端等區域的上游和下游(Song et al., 2011)。進一步的分析揭示基因附近富含5hmC意味著這個基因表達水平較高。Ficz 等人的實驗結果也顯示出啟動子區5hmC的含量與轉錄水平具有明顯的正相關性。而且發現這種關系部分依賴于啟動子的CpG密度。5hmC似乎可以減輕部分5mC的沉默效應，因為啟動子區含有5hmC和5mC的基因轉錄活性比啟動子只有5mC的基因高。與這些觀察相符的是，富含5hmC的啟動子都有組蛋白激活的標志H3K4me3 ，而富含5mC的啟動子缺乏H3K4me3 標志(Ficz et al., 2011)。另外有趣的是，隨著胚胎干細胞分化，多能性相關基因包括Esrrb, Prdm14, Dppas, Klfz, TCL1 和ZFP43的啟動子區5hmC水平顯著下降，而5mC水平卻明顯增加(Ficz et al., 2011)。

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