南京信帆生物：免疫電鏡膠體金標(biāo)記法操作大全

金標(biāo)法是Faulk和Taylor(1971)提出的，并首先用于免疫電鏡。它是利用膠體金在堿性環(huán)境中帶有負(fù)電的性質(zhì)，使其與抗體相吸附，從而將抗體標(biāo)記。當(dāng)用金標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)時，在光鏡水平膠金液呈現(xiàn)鮮艷的櫻紅色，不需加外進(jìn)行染色。在電鏡水平，金顆粒具有很高的電子密度，清晰可辨。因此，免疫電鏡膠體金標(biāo)記法近年來被成功地應(yīng)用于生物學(xué)的各個方面，并取得了要喜的進(jìn)展，解決了一些過去未能解決的問題，80年代以來似有取代免疫電鏡PAP技術(shù)的趨勢。膠體金標(biāo)記抗體技術(shù)在電鏡水平應(yīng)用有許多優(yōu)點(diǎn)：首先，手續(xù)不如PAP法煩瑣，不需用H2O2等損傷微細(xì)結(jié)構(gòu)的處理步驟，對微細(xì)結(jié)構(gòu)的影響較少。其次，金顆粒具有很高的電子密度，在電鏡下金顆粒清晰可辨，易于與其他免疫產(chǎn)物相區(qū)別。因此，金標(biāo)法還可以和PAP法相結(jié)合進(jìn)行雙重或多重染色的超微結(jié)構(gòu)定位。另外，利用不同直徑的金顆粒標(biāo)記不同的抗體，是研究突觸小泡內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)共存的有力工具。由于抗原抗體反應(yīng)部位結(jié)合金顆粒數(shù)量的多少可進(jìn)行粗略的免疫細(xì)胞化學(xué)定量研究。金標(biāo)抗體還可加入培養(yǎng)液中，對培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行標(biāo)記定位。曾有報告用金標(biāo)記法于細(xì)胞內(nèi)骨架的研究獲滿意的效果。由于金具有強(qiáng)烈的繼發(fā)電子的能力，因此，不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于掃描電鏡對細(xì)胞表面的抗原、受體進(jìn)行標(biāo)記定位觀察。金標(biāo)液無毒性，對人體無損傷。膠體金及膠體金標(biāo)記物的制備見第五章第3節(jié)。在原位分子雜交技術(shù)在電鏡水平的應(yīng)用中，膠體金的標(biāo)記術(shù)被科技工作者認(rèn)為是當(dāng)前的標(biāo)記物。

一、電鏡水平的免疫金染色法

應(yīng)用于電鏡水平的免疫法，可分為包埋前染色和包埋后染色，由于包埋前染色對細(xì)胞膜的穿透性差，一般只用于細(xì)胞表面的抗原標(biāo)記，如需穿透細(xì)胞膜，則需輔以凍融法或加入TritonX-100、皂素等活性劑，后者會加重細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的破壞，因此，現(xiàn)較普遍采用包埋后染色，現(xiàn)分別介紹如下：

1、包埋后染色

(1)超薄切片厚50～70nm左右，載于200～300網(wǎng)孔的鎳網(wǎng)上。

(2)置1%H2O2內(nèi)10min至1h(視樹脂的硬度和切片的厚度而定)，以去鋨酸和增進(jìn)樹脂穿透性，有利抗體進(jìn)入。如切片很薄或于低溫包埋時，此步可省略。操作時，滴入1%H2O2液1滴于蠟板上，將網(wǎng)的載片面輕浮于液滴上。對中樞神經(jīng)系統(tǒng)切片，有主張以1%過*(KIO4)代替H2O2的。

(3)雙蒸水洗3次，每次10min，第1，2次洗法如(2)，浮于液滴上，第3次以盛雙蒸水的注射器沿鎳網(wǎng)面沖洗，水流應(yīng)有適當(dāng)壓力，但不宜過高強(qiáng)，用濾紙在網(wǎng)緣將水吸干。

(4)浮于正常羊血清(1：50～1：100)滴上，室溫30～60min，以飽和固定劑中的游離醛基占據(jù)非特異性結(jié)合部位。

(5)PBS漂洗3min，洗1次(有人主張不洗)。

(6)濾紙吸干，孵育于*抗體血清滴上，先室溫預(yù)孵1h，再置于4℃24～36h.

(7)PBS漂洗3min，3次。

(8)PBS(內(nèi)含1%的牛血清白蛋白)pH8.2中，5min，此步為膠體金結(jié)合作準(zhǔn)備。

(9)膠體金標(biāo)記抗體液1：30～1：100，淡紅色為適宜稀釋液，室溫孵育10min至1h.

(10)雙蒸水洗3min，3次。

如作雙重染色，則應(yīng)將鎳網(wǎng)翻過來，用另一類抗體血清，重復(fù)上述步驟(2)～(10)。

(11)5%醋酸鈾(雙蒸水配制)染5min，然后用雙蒸水洗。

(12)枸櫞酸鈾(或醋酸鉛)染色5min，雙蒸水洗凈。

(13)電鏡觀察。

2、包埋前染色

(1)組織經(jīng)過適當(dāng)固定，為增強(qiáng)細(xì)胞穿透性，可在固定液中加入皂角素(Saponin)，使其濃度為0.01%，經(jīng)含皂角認(rèn)固定劑處理5～8min后，應(yīng)用0.01mol/lPBSPh7.4沖洗12h左右，中間換洗3～4次。

(2)組織切片貼于明膠涂抹的坡片上，細(xì)胞可制成混懸液，用離心法操作或制成涂片。

(3)0、05mol/lPBSpH7.4洗3min.

(4)以1：5正常羊血清處理切片30min室溫，以阻斷非特異性吸附。

(5)*抗體4℃孵育20h后室溫2h或過夜。

(6)0、05mol/lTBSpH7.4洗3min×3.

(7)0、02mol/lTBSpH8.2洗3min×3，為與膠體金結(jié)合作準(zhǔn)備。

(8)再次阻斷非特異性吸附，同(4)。

(9)以金標(biāo)記的第二抗體(工作濃度1：40左右)在室溫下孵育1h.

(10)0、05mol/lTBSpH8.2洗3min.

(11)0、05mol/lTBSpH7.4洗3min×3

(12)1%鋨酸(0.1mol/lPBS溶液)1h.

(13)雙蒸水洗15min.

(14)系列酒精或丙酮脫水，包埋、超薄切片。(15)枸椽酸鉛對照染色。

為增加抗非特異性染色，有的實(shí)驗(yàn)室傾向在TBS中加入1%小牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin,BSA,Sigma)。理想的免疫金染色切片，背景應(yīng)清潔，無殘留的金或其他無機(jī)鹽顆粒，金粒集中在抗原、抗體反應(yīng)部位。要獲得理想的免疫金染色切片，需注意的因素很多，其中主要的如：①抗體血清的高度特異性和親和力;②被檢組織應(yīng)有較高濃度的抗原;③沖洗液的清潔度，沖洗的*程度以及整個過程中應(yīng)用的各種器皿的清潔度等;④所有溶液用微孔濾過器(miliporefilter濾過)，濾膜孔徑0.2～0.45μm，所有器皿應(yīng)清潔和。整個操作過程應(yīng)在濕盒內(nèi)進(jìn)行，以使載網(wǎng)保持濕潤。

二、膠體金標(biāo)記蛋白A技術(shù)(ProteinA-goldtechnique,PAg法)

在電鏡水平應(yīng)用較為廣泛，因該法具有特異性中、靈敏度高、方法簡便和背景染色淡等優(yōu)點(diǎn)。蛋白A的免疫特異性在第五章已作了介紹，PAg復(fù)合物制備方法簡便，作為第二抗體，無種屬特異性，可以免去不同種屬動物要制備不同的特異性免疫球蛋白。PAg復(fù)合物與包埋劑和細(xì)胞成分都極少發(fā)生非特異性的交互作用，蛋白A和金粒間非共價的結(jié)合特性既不影響蛋白A的活性，又能保持高度的穩(wěn)定性，PAg復(fù)合物分子zui小易于穿透組織。

1、蛋白A-金(PAg)復(fù)合物的制備(Slot和Geuze,1981)

(1)膠體金液的制備，應(yīng)用枸椽酸三鈉還原法(見第五章)。

(2)待標(biāo)記蛋白質(zhì)和金溶液的準(zhǔn)備，同前。注意點(diǎn)是用0.2mol/lK2CO3將金溶液pH調(diào)至5.9～6.2之間。

(3)確定膠體金與蛋白A的結(jié)合用量比例。取一系列盛有0.1ml膠體金液的小玻璃管，分別加入不同量的蛋白A，5min后，再各加0.25ml10%的NaCl.如加入的蛋白A濃度不夠，不能穩(wěn)住金粒，在電解質(zhì)NaCl的影響下，金粒聚合沉淀，溶液由紅變藍(lán)。選擇能防止溶液由紅變藍(lán)的zui低濃度的蛋白A的量作為兩者的結(jié)合比例。以枸椽酸鈉法制成的膠體金每毫升約需要5μg蛋白A來結(jié)合，方能保證其穩(wěn)定性。

(4)膠體金與蛋白A的結(jié)合和純化，依上法測得所需的比例超過10%，即每30ml膠體中加入2mg蛋白A，5min后，加入0.3ml PEG作為穩(wěn)定劑，然后以15000r/min離心45min(不同方法制備的金離心速度不同)，略帶紅色的松散的復(fù)合物沉淀即為PAg復(fù)合物。小心棄去上清液，加入PBS沖洗，如上，松散的PAg復(fù)合物置于PBS溶液中，按0.2mg/ml的比例加入聚乙二醇作為穩(wěn)定劑，保存于硅化的玻璃器皿中備用，也有主張將上述PAg復(fù)合物放入3～6ml 5%甘油—0.05%聚乙二醇—0.02%疊氮鈉混合液中，再離心，棄去無色上清液后，收取管底部濃縮純化的PAg復(fù)合物置4℃保存。

據(jù)文獻(xiàn)報告，此PAg復(fù)合物的原液在4℃可保存達(dá)一年之久。

2、電鏡水平的PAg染色法 PAg法在電鏡技術(shù)的應(yīng)用原則是二步標(biāo)記法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要區(qū)別于一般膠體金免疫染色在：①須1%卵白蛋白—PBs (pH7.4)或1%卵白蛋白—0.05mol/l Tris緩沖液(pH7.4)來封閉非特異性的結(jié)合部位，而不是采用羊或其它的動物的正常抗血清，因?yàn)镻Ag復(fù)合物能夠與正常血清組中的Ig結(jié)合，從而給出假陽性結(jié)果;②在應(yīng)用*抗血清孵育和PBS沖洗后作第二抗血清即PAg復(fù)合物孵育前的準(zhǔn)備時，應(yīng)用的PBS或TBS的pH應(yīng)變更為pH7.4.在變更這兩步后，其它可參照本節(jié) 中包埋前、后染色法進(jìn)行。也可采用下列步驟進(jìn)行包埋后染色。

(1)載有超薄片的鎳網(wǎng)或金網(wǎng)浮于1%卵白蛋白—PBS液滴上，室溫約5min.

(2)載網(wǎng)不沖洗，直接移至*抗血清液滴上，在室溫孵育2h或4℃18～24h.

(3)PBS沖洗3min×2次。

(4)將PAg原液稀釋10～20倍，載網(wǎng)浮于該液滴上，室溫孵育1h.

(5)PBS沖洗5min×2次。

(6)5%醋酸鈾水溶液染色，水洗。

(7)枸椽柄鉛染色。

(8)電鏡觀察。

三、膠體金雙標(biāo)記技術(shù)(常用為蛋白A—膠體金)

1、單面法以不同直徑的金粒分別標(biāo)記兩種不同的抗體，以間接法先染*種抗體，洗凈后再染第二抗體。

2、雙面法以不同直徑的金粒標(biāo)記的抗體于鎳網(wǎng)的兩面分另進(jìn)行免疫染色。本法的優(yōu)點(diǎn)是可防止兩種金標(biāo)記的抗體的相互干擾，又可防止*次應(yīng)用的一抗與其相應(yīng)的抗原相結(jié)合，占據(jù)了空間，第二次應(yīng)用的抗體沒有適合的空間使之與相應(yīng)的抗原相結(jié)合。

3、異種動物抗原—抗體染色法如一抗分別用人與兔抗血清，人抗組織抗原A，兔抗組織抗原B.第二抗體分別以不同直徑金粒標(biāo)記的抗人和兔免疫球蛋白。由于種屬不同，兩種抗血清不會互相干擾，在應(yīng)用一抗和二抗時都可將兩種血清一次混合使用，將四步減少為兩步。

4、金標(biāo)記抗原檢查法(Gold—labelled antigen detection method, GLAD 法)此法是Larson(1977)年首先提出的，應(yīng)用放射性同位素如125I或酶標(biāo)記抗原進(jìn)行染色。先用特異性抗體與組織抗原反應(yīng)，標(biāo)記的純抗原又與特異性抗體反應(yīng)。Larson(1980，1981)又在此基礎(chǔ)上提出應(yīng)用膠體金在電鏡水平進(jìn)行雙抗原甚至多抗原定位。GLAD原理是：雙價的Ig抗體分子過量地加到有抗原的組織切片上，使分子的兩個抗原結(jié)合點(diǎn)中有一個結(jié)合到組織抗原上，而另一端可與標(biāo)記金的抗原起反應(yīng)。雙標(biāo)記時，預(yù)先將兩種不同的抗原標(biāo)以不同直徑的金粒，可分別與相應(yīng)的*抗體相結(jié)合，從而顯示出兩種抗原在組織切片的定位。此法的優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記物所顯示出的組織抗原的部位經(jīng)過兩次選擇，標(biāo)記了抗原只能與相應(yīng)的特異性抗體相結(jié)合而不能與切片中非特異性Ig相結(jié)合，因此具有較高的特異性。但由于使用此法時需備有與欲檢抗原相同的純抗原，并要對不同抗原分別進(jìn)行標(biāo)記，非一般實(shí)驗(yàn)室所能做到，所以至今尚未被廣泛應(yīng)用。

雙面金標(biāo)記法操作程序(Cai et al 1993, 改良自Bendayan et al 1982)。

(1)鎳網(wǎng)面A(樹脂包埋)

①蒸餾水沖10min.

②10% H2O2蝕刻10min室溫

③10%正常血清(以0.5mol/l Tris緩沖液pH7.4、含1%BSA和2%Tween20 稀釋，簡稱TBT緩沖液)室溫30min.

④以濾紙吸去多余液體，覆于特異性*抗體1：500(Tris 緩沖液，pH7.4,含1%BSA和0.1%疊氮鈉)4℃，孵育過夜

⑤*清洗，應(yīng)用0.5mol/L Tris緩沖液pH7.2,不含BSA

⑥繼之用0、5mol/L Tris緩沖液pH7.6,含1%BSA沖洗

⑦0、5mol/L Tris緩沖液pH8.2,含1%BSA，室溫孵15min

⑧羊抗兔IgG標(biāo)記以15nm金粒，應(yīng)用0.5mol/l Tris緩沖液pH8.2、含1%BSA稀釋1：40，孵育2h，室溫

⑨0、5mol/L Tris緩沖液pH7.4 沖洗

⑩蒸餾水沖洗

(2)鎳網(wǎng)面B，重復(fù)①～⑩，只在第④時更改另一特異性一抗，在⑧時羊抗兔IgG標(biāo)記以5nm金粒。

(3)鈾鉛雙重染色，電鏡觀察，可見二種不同直徑金粒標(biāo)記。

注意事項(xiàng)：①所有溶液均須經(jīng)加有微孔濾紙(0.45μm孔，國內(nèi)外現(xiàn)均有商品提供)的注射器過濾，過濾后直接以注射器沖洗。②濾紙用無纖維吸水濾紙。③沖洗在膠金標(biāo)記技術(shù)上是個決定性關(guān)鍵，僅次于抗體血清的純度。筆者的體會是一般應(yīng)漂洗3×5min，以注射器噴水漂洗效果優(yōu)于杯漂洗法，但漂洗水流需與網(wǎng)面平行，勿使水壓破壞切片。

四、免疫電鏡金—銀法染色技術(shù)

關(guān)于免疫金銀細(xì)胞化學(xué)的原理、試劑配制和光鏡顯示技術(shù)在本書第五章 已作了較詳盡的敘述。免疫金銀細(xì)胞化學(xué)技術(shù)說可應(yīng)用于電鏡水平。一般用于包埋前染色。其主要操作步驟如下：

(1)組織固定振動切片機(jī)切片10～30μm.

(2)人3%正常羊血清，含0.1%Triton X—100 的PBS孵育30min，以封閉非特異性結(jié)合部位

(3)1%硼氫化鈉的PBS孵育30min.

(4)一抗37℃，2h.

(5)PBS含0.1%BSA pH7.4 沖洗3min×3次。

(6)PBS含0.1%BSA pH8.2 沖洗3min×3次。

(7)人10～15nm金標(biāo)羊抗兔抗血清，工作濃度約1：10，37℃孵育45min.

(8)*液物理顯影(詳見第五章 第六節(jié) )。

(9)在解剖顯微鏡下取免疫反應(yīng)陽性部位，人1%鋨酸后固定20min，常規(guī)脫水，樹脂包埋。

(10)超薄切片機(jī)切0.1μm左右半薄切片，定位陽性反應(yīng)部位，制超薄切片。如有暗視野微鏡則更有助于定位。在暗視野前景下，金銀粒呈金黃色閃光顆粒，即使微量金銀也可定位，微鏡則更有助于定位。在暗視野前景下，金銀粒呈金黃色閃光顆粒，即使微量金銀也可定位。

(11)鈾—鉛電鏡染色，電鏡觀察。

免疫金銀法敏感度高，金銀顆粒電子密度高，反差強(qiáng);應(yīng)用包埋前染色可先定位陽性反應(yīng)部位再作電鏡超薄切片，獲得陽性反應(yīng)機(jī)率高，特別適用于含微量抗原的部位，如突觸等。其不足是須經(jīng)暗室顯影，手續(xù)較煩雜，包埋前免疫染色易增加非特異性染色。另外，由于單個金粒周圍結(jié)合的銀粒不是固定的，受多種因素影響。因此，電鏡免疫金粒染色法的金粒銀粒計算不適于做半定量觀察，誤差較大。

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