RNA pulldown步驟方法

RNA結合蛋白(RBPs)在轉錄后水平調節(jié)基因的表達起著重要的作用，具體的作用包括mRNA前體的剪接、多腺苷化和穩(wěn)定性的維持，mRNA從細胞核向細胞質的運輸，mRNA的定位和翻譯等。RBPs在這些過程中的調節(jié)作用是通過結合新合成的或者成熟后的轉錄物的特定序列實現(xiàn)的。于此同時，有很多RBPs能夠識別RNA中的特定核苷酸序列。
RNA pulldown方法，其特征在于，包含以下步驟：S1、磁珠預處理：使用BSA和寡核苷酸隨機引物封閉鏈霉親和素標記的磁珠；S2、制備探針?磁珠復合物：將步驟S1預處理的磁珠與*標記的RNA探針結合；S3、提取并預處理細胞全蛋白：向提取的細胞全蛋白中加入脫氧核糖核酸酶孵育，再加入未預處理的磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；S4、pulldown：將步驟S3收集的上清加入到步驟S2制備的探針?磁珠復合物中，加入脫氧核糖核酸酶抑制劑和核糖核酸酶抑制劑孵育，收集磁珠，用含核糖核酸酶抑制劑的NT2 buffer洗滌磁珠，得到蛋白?探針?磁珠復合物；S5、RNP的收集：將步驟S4制得的蛋白?探針?磁珠復合物加入Urea CHAPS buffer孵育，去除磁珠，收集上清即得RNP。