上一期中我們介紹了Orbitrap Eclipse™三合一質譜儀極其出色的硬件性能，以及在蛋白質組學領域的非凡表現。本期帶大家領略其如何將生物制品質譜表征工作變得更簡單、看到生物制品真實的原貌！

當前常規生物制品質譜表征主要包含完整分子量的測定、肽圖解析、糖型鑒定等，通常利用不同的樣品前處理獲得復雜生物制品的完整分子量、氨基酸序列結果，然而在一定程度上卻失去了樣品的完整信息，引入其他副反應。大家知曉可以用Top-Down、Middle-Down的分析流程解決這一問題，但由于質譜儀性能的局限，未得到廣泛的應用。

賽默飛作為科研領域的先者，致力于解決分析難題，型Orbitrap Eclipse™將“簡單又復雜”的生物制品質譜表征帶入了“Top/Middle-Down時代”。

1復雜生物制品的完整分子量測定——糖基化位點較多的融合蛋白類

得益于PTCR（質子轉移電荷減少）技術、深度真空技術（氣壓可調0.5-20mTorr）。

單克隆抗體及ADC類蛋白樣品異質性相對較低，在傳統的LC-MS/MS（變性反相色譜或非變性分子排組色譜條件）中能夠獲得高信噪比、高質量精度的各成分及其含量分布。而含N-糖或O-糖位點較多的融合蛋白類，如細胞因子融合蛋白，異質性非常高，即使在非變性去唾液酸條件下仍舊無法有效區分每一成分（圖1A），通常的解決方式是使用各種糖苷酶去除不同種類糖型，降低譜圖復雜性，然而卻失去了樣品的完整水平糖型信息。

圖1. 細胞因子融合蛋白分子量測定; 1A. 去唾液酸后在native條件質譜圖 1B.經過PTCR反應后質譜圖 1C.經BioPharma軟件去卷積后的各成分質量(Data Courtesy: Wendy Sandoval, Genentech)

Orbitrap Eclipse™ 針對不同的樣品分析可調節IRM中氣壓，提高信號響應，以及PTCR強力的加持技術則可簡單快速的解決此類困擾已久的難題，如圖1所示，在圖1A中選擇帶多質子且信號強度較高的m/z5677-5757范圍，經PTCR反應后降低質子數，從而降低各電荷態間的重疊度（圖1B），此時可清晰的分辨每一成分，BioPharma Finder軟件去卷積后獲得該融合蛋白主要成分的分子量（圖1C），為復雜生物制品的表征提供完整信息。

2非變性蛋白Top-Down分析

得益于ETD、EThcD、UVPD、HCD、深度真空技術、HMR?、PTCR技術

（型Orbitrap Eclipse™三合一質譜儀集各種利器于一身）

對于做蛋白藥物質譜表征分析的人來說，理想的狀態是使用快速簡單甚至無需樣品前處理，直接進入LC-MS/MS或MS only對蛋白藥物進行表征，且降低樣品前處理引入的干擾，同時可直接對電荷變異體成分進行快速的確證。而現實是由于抗體分子大，碎片離子少且復雜導致在完整蛋白水平獲得較低的序列覆蓋度，實用價值低。Orbitrap Eclipse™將非變性完整蛋白Top-Down分析推向嶄新的高度。

以Herceptin®抗體為例，溶液置換成50mM乙酸銨（Herceptin®濃度為2ug/uL），不經LC通過注射泵直接進入MS中，獲得高信噪比高質量精度的一級譜圖（圖2），隔離豐度的母離子（+27價）分別進行HCD、ETD、EThcD及UVPD的碎裂，且使用Orbitrap 240,000分辨率進行高準確度二級碎片離子掃描，由于Orbitrap Eclipse™具有HMR?選項，可在二級譜圖中看到m/z達8000的豐富碎片離子。

圖2.非變性Herceptin®高質量精度的一級質譜圖，不同碎裂模式下的二級質譜圖

圖3. 經BioPharma Finder解析后輕重鏈氨基酸序列覆蓋度

經BioPharma Finder解析后，輕鏈氨基酸序列覆蓋度為57%，重鏈氨基酸序列覆蓋度為36%（圖3），碎片離子質量偏差在3ppm以內，Orbitrap Eclipse™在非變性條件下Top-Down結果刷新了以往的記錄?¹?。

值得注意的是，PTCR技術不僅在復雜生物制品分子量測定中大顯身手，而且能夠顯著降低ETD MS²譜圖的復雜度（圖4），大大提高質量碎片離子的解析度（圖5），從而提升Middle-Down氨基酸序列的覆蓋度（圖6）。

圖4.NIST mAb Fd亞基經ETD碎裂以及PTCR反應后的二級碎片離子質譜圖

圖5.ETD only與ETD with PTCR二級/三級碎片離子鑒定分布圖

圖6.NIST標準抗體Middle-Down氨基酸序列覆蓋度

3基于以上*的優勢性能，可進一步擴展其應用領域

如電荷變異體的快速鑒定；利用MHC(Major Histocompatibility Complex)-peptide復合物篩選高免疫原性疫苗時，采用Orbitrap Eclipse™測定復合物的完整分子量和Top-Down，來評估多肽的交換（圖7）；此外多種碎裂方式與超高分辨率Orbitrap的組合能夠更加準確的對未知蛋白進行從頭測序（De-novo sequencing）。

圖7.Orbitrap Eclipse™評估MHC與多肽的交換，助力高免疫原性疫苗的篩選（Data Courtesy :Genentech）

結語：目前Orbitrap Eclipse™是功能為齊全的高分辨質譜儀之一，旨在解決蛋白質分析中挑戰的問題，持此利器定能推動生物學研究的進一步發展。

至此，ASMS新品連載正式完結啦！快和賽默飛一起回顧下賽默飛2019新品質譜的精彩瞬間~

賽默飛于ASMS 2019上發布的兩款新品質譜再次刷新了Orbitrap的記錄——

全新一代Q Orbitrap旗艦機 Orbitrap Exploris™480 質譜儀，體積小巧但性能*，穩定耐久。天才不“繁”，勢必將蛋白質組學，尤其是臨床蛋白質組學研究推向新的高度。

堪稱創新之作的型Orbitrap Eclipse™三合一質譜儀，集各種高能軟硬件技術于一身，性能比尖，輕松應對蛋白質組學，生物制藥與蛋白質結構分析研究中的各項挑戰。

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