干貨分享：多肽類(lèi)藥物雜質(zhì)的鑒定，提高雜質(zhì)鑒定的通量和準(zhǔn)確度

根據(jù)美國(guó)藥典（USP）多肽藥物指在不考慮工藝的條件下，氨基酸數(shù)目≤40屬于多肽藥物；當(dāng)采用化學(xué)合成方法制備時(shí)，其多肽藥物指氨基酸數(shù)目<100。

多肽類(lèi)藥物的制備目前主要有化學(xué)合成、基因重組和從動(dòng)植物中提取三種方法。其中固相多肽合成技術(shù)的產(chǎn)生極大推動(dòng)了多肽藥物的發(fā)展，本篇主要利用雙三元液相與Orbitrap高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，鑒定了多肽類(lèi)藥物胸腺法新的相關(guān)降解雜質(zhì)。

背 景

胸腺法新是由28個(gè)氨基酸組成的多肽，相對(duì)分子質(zhì)量3108.28。注射用胸腺法新是胸腺法新加適量賦形劑制成的無(wú)菌凍干粉針，主要用于治療慢性乙肝、丙肝，也可與其他藥物聯(lián)用治療腫瘤、免疫缺陷等疾病。目前胸腺法新的合成方法主要為固相多肽法，合成步驟煩瑣，易產(chǎn)生與胸腺法新結(jié)構(gòu)類(lèi)似的雜質(zhì)[1]。

雜質(zhì)的類(lèi)型主要分為兩類(lèi)，一類(lèi)為固相合成工藝相關(guān)的雜質(zhì)，如氨基酸的去除、插入、氧化以及殘留溶劑、試劑、無(wú)機(jī)雜質(zhì)等。另一類(lèi)來(lái)源多肽的降解，如通過(guò)β-消除反應(yīng)、焦谷氨酸和琥珀酰亞胺的形成。通過(guò)對(duì)雜質(zhì)的深入分析可以指導(dǎo)工藝的改進(jìn)并保證用藥的安全性。當(dāng)相關(guān)的雜質(zhì)高于0.1%時(shí)需要體現(xiàn)，高于0.5%時(shí)需要進(jìn)行鑒定，高于1%時(shí)則需要定量，總雜質(zhì)的含量要小于5%[2]。

2015版中國(guó)藥典采用LC-UV主成分自身對(duì)照法對(duì)單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總量進(jìn)行了規(guī)定，但標(biāo)準(zhǔn)方法中流動(dòng)相為硫酸銨緩沖液-乙腈系統(tǒng)由于緩沖液與質(zhì)譜不兼容，因此當(dāng)進(jìn)行雜質(zhì)鑒定時(shí)，傳統(tǒng)方法需對(duì)目標(biāo)雜質(zhì)峰進(jìn)行收集、富集、除鹽、旋干再鑒定，過(guò)程繁瑣、且增加了雜質(zhì)成分降解等不確定影響因素。

方 案 特 點(diǎn)

利用賽默飛特色的雙三元液相色譜多組分中心切割二維在線(xiàn)除鹽方法，可實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣即可完成多組分除鹽的目的，電霧式檢測(cè)器（CAD）作為一種通用型檢測(cè)器可輔助建立除鹽方法，評(píng)價(jià)除鹽效果。

在確定了二維除鹽條件后，利用Orbitrap高分辨質(zhì)譜的高分辨率、出色的靈敏度、高質(zhì)量精度等優(yōu)勢(shì)性能，對(duì)已在線(xiàn)脫鹽的未知雜質(zhì)組分進(jìn)行的鑒定。大大的提升了樣品的穩(wěn)定性和分析效率（全自動(dòng)在線(xiàn)多組分切割2DLC系統(tǒng)設(shè)計(jì)如下圖）。

全自動(dòng)在線(xiàn)多中心切割2DLC在線(xiàn)除鹽系統(tǒng)流路示意圖（點(diǎn)擊查看大圖）

實(shí) 驗(yàn) 方 法

液相方法

維液相方法同2015版藥典，各雜質(zhì)分離良好，其中面積歸一化含量在0.1%以上的雜質(zhì)共為11個(gè)，因此本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)11個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行定性鑒別。第二維除鹽過(guò)程采用AcclaimC18（300Å），乙腈-0.1%甲酸作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度分析，輔以CAD檢測(cè)，確定了二維的除鹽和分離條件。

樣品在一維標(biāo)準(zhǔn)方法下的分離譜圖（上圖）及主要目標(biāo)雜質(zhì)被切割至第二維在線(xiàn)脫鹽后的典型總離子流圖（點(diǎn)擊查看大圖）

質(zhì)譜方法

一級(jí)全掃描：分辨率70,000;掃描范圍:300-1700m/z;

二級(jí)為數(shù)據(jù)依賴(lài)型掃描模式，分辨率35,000;歸一化碎裂能量（SteppedNCE）：20,23,26;動(dòng)態(tài)排除10s

數(shù)據(jù)處理

使用Thermo Scientific™ BioPharmaFinder軟件，根據(jù)胸腺法新的氨基酸序列進(jìn)行相關(guān)雜質(zhì)的鑒定。由于高分辨質(zhì)譜的高專(zhuān)屬性和高靈敏度的特性，因此每個(gè)雜質(zhì)組分中會(huì)鑒定到多種成分。氨基酸序列性質(zhì)相似時(shí)，其離子化效率接近，根據(jù)其質(zhì)譜中的相對(duì)豐度可對(duì)每個(gè)組分中的每一成分進(jìn)行初步的相對(duì)定量（注：主成分切到質(zhì)譜中進(jìn)行鑒定只是少部分）。1-6雜質(zhì)組分的鑒定結(jié)果下圖，7-11組分的鑒定結(jié)果如圖3B，每一成分的一級(jí)質(zhì)量偏差均小于2ppm。

雜質(zhì)組分1-6的鑒定結(jié)果（圖上數(shù)字代表該成分的保留時(shí)間）（點(diǎn)擊查看大圖）

雜質(zhì)組分7-11的鑒定結(jié)果（點(diǎn)擊查看大圖）

小 結(jié)

傳統(tǒng)在線(xiàn)除鹽方法多采用1個(gè)或2個(gè)loop環(huán)進(jìn)行目標(biāo)物收集，但當(dāng)樣品雜質(zhì)較多，且標(biāo)準(zhǔn)方法分析時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)（本實(shí)驗(yàn)樣品分析時(shí)間為60min），將極大的影響雜質(zhì)的分析效率，而手工收集也可能會(huì)引入其他降解產(chǎn)物的產(chǎn)生。

采用6個(gè)loop環(huán)的多中心切割方法，一次進(jìn)樣可完成多目標(biāo)雜質(zhì)的在線(xiàn)除鹽，顯著的提高鑒定的通量，同時(shí)與Orbitrap高分辨質(zhì)譜聯(lián)用，強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，提高雜質(zhì)鑒定的通量和準(zhǔn)確度，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供有力的數(shù)據(jù)支撐。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]程磊,唐洋明,殷果,等.HPLC法對(duì)胸腺法新及其制劑中雜質(zhì)檢查[J].藥物分析雜志,2013(11):1942-1947.

[2]D’hondt,Matthias,etal."Relatedimpuritiesinpeptidemedicines."Journalofpharmaceuticalandbiomedicalanalysis101(2014):2-30.

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