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前兩期中，我們分別介紹了Orbitrap Exploris™ 480的設計原則和硬件性能，的定性能力，FAIMS Pro可選組件以及對TMT定量的改進。本期，飛飛將為您展示Orbitrap Exploris™ 480絢爛的一筆——

豐富的定量流程

BoxCar,  SureQuant定量流程

隨著蛋白質組學的進一步發展，只適用于發現階段的數據依賴采集模式（Data Dependent Acquisition, DDA; 例如非標記定量，SILAC, TMT, 穩定同位素二甲基標記等定量蛋白質組學方法都屬于這一范疇）已經不能*跟上日益提高的分析需求，尤其是針對臨床大隊列的轉化醫學研究。而隨后發展的DIA?¹?, PRM?²?等靶向或者擬靶向技術則進一步*基礎研究和臨床應用的隔閡。

Orbitrap Exploris™ 480對于上述涉及的所有定量方法都給出了非常完善的支持，除此之外Orbitrap Exploris™ 480上的兩個新的定量方法也極大的豐富了現有的定量流程。

2018年Matthias實驗室在Nature Methods上發表了全新的BoxCar的采集方式（圖1）。

圖1.BoxCar采集方式示意（點擊查看大圖）

BoxCar采集方法的核心思想在于一級全掃時采用分段累積，合并掃描的multi-plexing full scan來規避在同一張full scan中高豐度肽段對于低豐度肽段的信號壓制，從而提升一級全掃的動態范圍和觸發二級的靈敏度。

并且借助MaxQuant軟件的“Match Between Runs”功能，還可以使用一級質譜feature的質核比和保留時間來進行不依賴于二級鑒定的定量模式。BoxCar的采集模式對于動態范圍大的樣本會有比較顯著的鑒定深度優勢。Orbitrap Exploris™ 480對于BoxCar的采集模式提供了更好的兼容性，例如將Spectral Multiplexing從10提升至了20, 以支持更為密集的BoxCar隔離窗口。通過對未進行高豐度蛋白去除的血漿樣品的分析我們可以看到，采用BoxCar的集采模式相較于傳統DDA顯著增加了肽段和蛋白的鑒定數量（圖2-(a,b,c,d)）。

圖2-(a,b,c,d) Orbitrap Exploris™ 480上使用BoxCar DDA模式對血漿樣品進行分析（點擊查看大圖）

SureQuant-超高通量的PRM定量方法

平行反應監控（Parallel Reaction Monitoring, PRM）是Orbitrap系列儀器上的高分辨靶向定量方法，類似于三重四極桿質譜上的選擇反應監控（Selected Reaction Monitoring, SRM）,其是進行潛在標志物驗證的金標準方法之一。

但是PRM一直受到通量問題的困擾，即使采用動態保留時間，也難以在一針采集中同時監控上百條肽段。因此，在2015年Gallien等人在MCP上發表了Internal-Standard triggered PRM（IS-PRM）的方法，其核心思想為對內標肽段進行一個低分辨，低離子注入時間的PRM掃描（內標的含量通常比較高，因此不會受到靈敏度影響），隨后在線對該PRM掃描進行實時譜圖檢索，若能夠匹配到目標序列則觸發對應內源肽段的高分辨，高離子注入時間的PRM掃描用于定量???。該方法由于需要使用賽默飛提供的API對儀器控制軟件進行編程修改，因此一直未能得到廣泛應用。

而Orbitrap Exploris™ 480上則提供了商品化的，即時可用的SureQuant定量方法，其核心思想和IS-PRM類似，但是其實現更為巧妙和便捷。SureQuant定量流程巧妙的采用了數據依賴的采集方法來實現IS-PRM相同的功能（圖3）。

來看我的新方法

首先我們會進行一個一級的全掃，然后采用inclusion list triggered MS² 來對同位素標記的內標肽段進行二級質譜的掃描（inclusion list中包含了所有需要檢測的內標肽段），由于內標肽段通常都以較高的濃度摻入，因此針對內標肽段的二級質譜我們會采用低分辨率和低離子注入時間來進行, 從而盡可能的節省掃描時間。隨后我們將采集的內標肽段的二級質譜進行快速的在線譜圖匹配，如果能否匹配到目標內標肽段序列則觸發一個針對內源肽段的二級質譜掃描（通過的mass shift來實現），而內源肽段的濃度通常較低，因此我們采用一個高分辨率，高離子注入時間的二級掃描來盡量提升檢測的靈敏度。在SureQuant流程中，我們進行DDA的二級掃描時不設置動態排除，因此內源和內標肽段都可以得到完整的PRM的采集譜圖。

圖3. SureQuant定量流程示意

舉個例子

我們以未進行高豐度蛋白去除的血漿蛋白定量作為一個例子。PQ 500 kit中包含了500個血漿蛋白的重同位素標記內標肽段，總計804條重標肽段，可用于對血漿蛋白進行高通量的靶向定量。采用SureQuant定量流程，我們可以通過70分鐘梯度的質譜分析實現每針超過550個內源肽段的定量，并且三針之間的檢出重復性非常之高（圖4）。定量的動態范圍從柱上15 pmol到4amol, 跨度大于6個數量級，并且重復進樣體現出了相當高的定量重現性（圖5）。

圖4. 采用SureQuant定量流程對未進行高豐度蛋白去除的血漿樣品進行定量分析（點擊查看大圖）

圖5. 血漿蛋白定量的動態范圍和重現性（點擊查看大圖）

蛋白質組學新高度

經過三期的介紹，我們發現Orbitrap Exploris™ 480質譜儀作為全新一代Q Exactive系列旗艦機型，是一款以高性能，穩定性和耐久性為主要考量因素的高分辨質譜儀。，其可以滿足絕大多數蛋白組學，轉化醫學和生物制藥的分析需求，并且顯著提升實驗室數據的產出質量和通量。勢必將蛋白質組學，尤其是臨床蛋白質組學研究推向新的高度。

參考文獻：

1.Bruderer, R., et al., Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues. Mol Cell Proteomics, 2015. 14(5): p. 1400-10.

2.Peterson, A.C., et al., Parallel reaction monitoring for high resolution and high mass accuracy quantitative, targeted proteomics. Mol Cell Proteomics, 2012. 11(11): p. 1475-88.

3.Meier, F., et al., BoxCar acquisition method enables single-shot proteomics at a depth of 10,000 proteins in 100 minutes. Nat Methods, 2018. 15(6): p. 440-448.

4.Gallien, S., S.Y. Kim, and B. Domon, Large-Scale Targeted Proteomics Using Internal Standard Triggered-Parallel Reaction Monitoring (IS-PRM). Mol Cell Proteomics, 2015. 14(6): p. 1630-44.

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