蝦白尾病（WTD）RT-PCR 檢測試劑盒（MrNV）說明書

1、蝦白尾病（WTD）RT-PCR 檢測試劑盒（MrNV）簡介 
貨號：HB-810-3 
蝦白尾病（White tail disease，WTD）也稱為白肌肉病（White muscle disease，WMD）或羅
氏沼蝦肌肉白濁病（Macrobrachium rosenbergii Whitish muscle disease）,主要在亞洲和南美洲
北部流行。其主要病原為羅氏沼蝦野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus，MrNV），
研究發現感染對蝦中還存在另外一種超小型病毒（Extra small virus，XSV），為 MrNV 的微型病毒。
蝦感染后腹部、尾部出現白色渾濁，Z終可擴散全身肌肉，死亡率可達 95%以上。
為了適應蝦白尾病快速檢測和疫病研究的需要，本公司參考國家質檢總局發布的《白尾病檢疫
技術規范》（SN/T 3583-2013）中*的的引物和探針序列，經多次實驗及系統優化，開發生產了
本試劑盒。應用本試劑盒進行檢測具有快速、靈敏、特異、準確、安全操作簡單、應用廣泛和高通
量檢測等特點及優點。
2、 試劑盒組成 
試劑盒組成包括核酸擴增試劑。具體組成參見表 1：
表 1：試劑盒組成（50test/盒）
試劑盒組成成分 體積 
*： 核酸裂解液 15ml×2 管
核酸擴增試劑： DEPC 水
WTD-MrNV RT-PCR 反應液
酶混合物
陰性對照
WTD-MrNV 陽性對照
1ml×1 管
750µL×1 管
60µL×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
（注：*可使用本公司生產的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》） 
3、 樣本采集,存放及運輸 
3.1 樣本采集：所用取樣器材必須經高壓滅菌并烘干。隨機取5只-10只新鮮的蝦作為采樣標本，采
集的部位包括：蝦頭部的鰓絲、肝胰腺、淋巴器官或血淋巴等組織（可部分或全部采集這些組織）。
對于仔蝦或稚蝦，取整只蝦或蝦頭作為樣品；蝦糞便直接勻漿待檢。詳見相關標準。
3.2 存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應不超過 24 h；-70 ℃以下可*保存，但應避
免反復凍融（Z多凍融 3 次）。
3.3 運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸。
4、 RT-PCR 檢測 
4.1 RNA 核酸提取操作方法 
4.1.1 取 n 個滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，其中 n 為被檢樣品與陰性對照的和（陽性對照、陰性對照在試劑盒中已標出），做標記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需提
取核酸)
4.1.2 每管加入 600 ?L 裂解液，分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 ?L，一份樣本換用一個吸頭，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過于強烈，以免產生乳化層，也可以用手顛
倒混勻），于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。
4.1.3 蝦白尾病（WTD）RT-PCR 檢測試劑盒（MrNV）取與 4.1.1.1 相同數量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，加入 500 ?L 異丙醇（-20℃預冷），做標記。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉移至相應的管中，上清液應至少吸取 500?L，不能吸出
中間層，顛倒混勻。
4.1.4 于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），小心
倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；加入 600 ?L 75％
乙醇，顛倒洗滌。
4.1.5 于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），小心
倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）。
4.1.6 4 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），將管壁上的殘余液
體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不要碰到有
沉淀一面，室溫干燥 3 min，不能過于干燥，以免 RNA 不溶。
4.1.7 加入 11 ?L DEPC 水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存備用。
提取的 RNA 須在 2 h 內進行 PCR 擴增；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內。
【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書》（貨號：HB-QPCR-01）使用，更方便快捷提取
核酸】。
注：提取的 RNA 須在 2 h 內進行 PCR 擴增；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內。 
4.2 RT-PCR 檢測 
4.2.1 擴增試劑準備（在反應混合物配制區進行）：
從試劑盒中取出相應的 RT-PCR 反應液、酶混合物，在室溫下融化后，2000 r/min 離心 5 s。每
個樣品測試反應體系配制見表 2：
表 2 每個樣品測試反應體系配制表
試劑 RT-PCR 反應液 酶混合物
用量 15 μL 1.0 μL
4.2.2 加樣（樣本處理區進行）：
向每個PCR管空中各分裝15ul的混合液，再分別加入上述樣本處理步驟4.1.7中制備的RNA溶液各
10 ?L，蓋緊管蓋，500 r/min離心30 s。
4.2.3 RT-PCR 檢測（在檢測區進行）：
*階段：42 o
C /30 min；
第二階段：95oC /2 min；
第三階段：94 oC /40 sec, 55 oC /40 sec，72 oC /1 min，35個循環；
第四階段：72 oC /10 min; 
第五階段：4 oC 保存
4.3 瓊脂糖電泳 
用電泳緩沖液制備 1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好沒過膠
面，向 PCR 擴增產物中加入 1/6 體積的電泳上樣緩沖液（6X 上樣緩沖液），按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時設立 DNA DL2000 Marker 做對照。5 V/cm 電泳約 0.5h，當溴酚藍到達一定位置時停止。
在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴增出預期的特異性 DNA 電泳帶，拍攝并記錄。
5、結果判定 
5.1 RT-PCR 后，陽性對照會出現一條 425 bp 的 DNA 片段。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶。
5.2 蝦白尾病（WTD）RT-PCR 檢測試劑盒（MrNV）待測樣品 PCR 擴增后能在相應 425 bp DNA 位置上有帶，可判為 MrNV 核酸陽性。