大鼠O-6甲基*DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Elisa試劑盒實驗原理

大鼠O-6甲基*DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）Elisa試劑盒實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中大鼠O-6 甲基*DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）
水平。用純化的大鼠O-6 甲基*DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）抗體包被微孔板，制成固相
抗體，往包被單抗的微孔中依次加入O-6 甲基*DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT），再與HRP
標記的O-6 甲基*DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合
物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作
用下轉(zhuǎn)化成Z終的黃色。顏色的深淺和樣品中的O-6 甲基*DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）
呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中大鼠
O-6 甲基*DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）濃度。
標本要求
1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能
馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2．不能檢測含NaN3 的樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀
釋。
80pg/ml 5 號標準品 150μl 的原倍標準品加入150μl 標準品稀釋液
40pg/ml 4 號標準品 150μl 的5 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
20pg/ml 3 號標準品 150μl 的4 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
10pg/ml 2 號標準品 150μl 的3 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
5pg/ml 1 號標準品 150μl 的2 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、
待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，
然后再加待測樣品10μl（樣品Z終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡
量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
4. 配液：將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此
重復(fù)5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
10 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應(yīng)在加終止
液后15 分鐘以內(nèi)進行。
大鼠O-6甲基*DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）Elisa試劑盒操作程序總結(jié)：
計算
以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的
OD 值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD 值計算出標
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，
即為樣品的實際濃度。
注意事項
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未
用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間
控制在5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，*使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD 值
大于標準品孔*孔的OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計
算時請Z后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
大鼠O-6甲基*DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）Elisa試劑盒保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6 個月