人源細胞進行染色的工作原理

人源細胞將rMSCs接種于24孔板中, 24 h 后饑餓處理24 h。配置適量30 μmol/L EdU培養(yǎng)基, 無血清培養(yǎng)組作為對照組, 10%血清*培養(yǎng)基組作為陽性對照組。細胞在各組EdU培養(yǎng)基中孵育24 h后通過4%多聚甲醛固定細胞。Apollo®和Hoechst33342分別對新生細胞核以及全部細胞核進行染色, 熒光顯微鏡下觀察并照相記錄, 利用ImageJ2對結(jié)果進行分析處理。

 RT-PCR

 使用RNA提取試劑盒提取細胞總 RNA, 根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄。在RTPCR反應中, SDF-1、CXCR4和β-actin的引物序列見表1。PCR擴增條件為: 97 °C預變性3 min; 97 °C 變性15 s, 55.5 °C退火30 s, 72 °C延伸15 s, SDF-1、 CXCR4和β-actin的循環(huán)次數(shù)分別為29、33和21; 72 °C 延伸7 min。PCR產(chǎn)物通過Gold View核酸染料染色的 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離。以β-actin為內(nèi)參評價SDF-1和CXCR4基因水平表達的變化。
 Western blot

加入含有蛋白酶抑制劑以及磷酸酶抑制劑混合物I和II的細胞裂解液提取蛋白, 通過10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白質(zhì), 電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫孵育1 h后分別與CXCR4、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)和總ERK1/2(t-ERK1/2)抗體4 °C孵育過夜, 人源細胞與辣根過氧化物酶標記的二抗(山羊抗兔)室溫孵育1 h。ECL發(fā)光液顯色后通過Bio-Rad顯影儀采集分析圖像。以 β-actin為內(nèi)參評價CXCR4蛋白水平的表達變化, 以 t-ERK1/2為內(nèi)參評價p-ERK1/2的表達變化。
 Nogo受體作用蛋白IgG     磷酸化鳥苷酸調(diào)節(jié)蛋白12    小鼠水通道蛋白2(AQP-2)
 NUP54IgG     酸敏感離子通道1    小鼠水通道蛋白1(AQP-1)
 N-鈣粘附分子IgG     p53凋亡刺激蛋白1    小鼠水通道蛋白0(AQP-0)
 N-甲基嘌呤DNA糖基化酶IgG     P53凋亡刺激蛋白2    小鼠瘦素(LEP)
 N-乙?；D(zhuǎn)移酶2IgG     谷草轉(zhuǎn)氨酶    小鼠嗜酸性粒陽離子蛋白(ECP) 
 O6甲基*DNA甲基轉(zhuǎn)移酶IgG     G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白1    小鼠嗜酸粒趨化因子(ECF)
 p19ARF抑癌基因IgG     血管緊張素原    小鼠嗜酸粒趨化蛋白Eotaxin 1(Eotaxin 1/CCL11)
 p21IgG     磷酸化G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白1    小鼠嗜環(huán)蛋白/親環(huán)素A(CyPA) 
 p21激活激酶1IgG     磷酸化G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白1    小鼠*結(jié)合蛋白4(RBP-4) 
人源細胞