腫瘤細胞培養技術

什么是腫瘤細胞培養?
顧名思義，從體內分離出來的組織或細胞的*次培養稱為原代培養。更成熟的概念是，凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經特殊分離方法制備而來的原初培養的細胞稱之為原代細胞。細胞的純化或細胞克隆技術是細胞培養工作的基礎。
原代細胞培養的原理
將動物機體的各種組織從機體中取出，經各種酶(常用*)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養。

原代細胞培養的應用
(1)為研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段;
(2)為傳代培養創造條件;
(3)服務于臨床實踐，用于藥物篩選等。

原代細胞培養的步驟：取材→分離→培養和維持
1、取材
人和動物細胞的取材是原代細胞培養成功的首要條件，直接影響細胞的體外培養。
(1) 取材的基本要求
① 取材要注意新鮮和保鮮
② 應嚴格無菌
③ 防止機械損傷
④ 去除無用組織和避免干燥
⑤ 應注意組織類型、分化程度、年齡等
⑥ 作好記錄

(2)各類組織的取材技術
① 皮膚和粘膜的取材
主要取自于手術過程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術操作，但面積一般2~4平方厘米。
② 內臟和實體瘤的取材
內臟除消化道外基本是無菌的，但取材時要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實體瘤取材時要取腫瘤細胞豐富的區域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結締組織。
③ 血液細胞的取材
血細胞、淋巴細胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中(如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結等)分離細胞，取材時應注意抗凝。
④ 骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材
嚴格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養液洗一次后即可培養，不宜低溫存放。
⑤ 動物組織取材
I 鼠胚組織取材
首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物，然后將其整個浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后(注意時間不能太長，以避免酒精從口或其他通道進入體內，影響組織活力)，取出動物，在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無菌*挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環形剪開皮膚，用*分別挾住兩側皮膚拉向頭尾，把動物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無菌解剖器材，采用無菌操作法解剖取出胚胎。
II 幼鼠胚腎(或肺)取材
幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開游離毛皮并拉開至兩側：然后采用無菌法打開胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開游離并拉向兩側，然后采用無菌法從背部打開腹腔取腎。
⑥ 雞(鴨)鳥類胚胎組織取材步驟
1、取孵化至適當胚齡(9~12天)的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運動的胚蛋，說明胚體發育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。
2、將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干;
經碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼;
3、用*撕去殼膜，暴露出雞胚;
4、用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。

2、分離
人或動物體內(或胚胎組織)由于多種細胞結合緊密，不利于各個腫瘤細胞在體外培養中生長繁殖，必須將現有的組織塊充分散開，使細胞解離出來。
(1)懸浮細胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，zui簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據需要收獲目的細胞。
(2)實體組織材料的分離方法
對于實體組織材料，由于細胞間結合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法(物理裂解)和消化分離法。
① 機械分散法
特點:簡便、快速,但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。
② 消化分離法
組織消化法是把*切成較小團塊(或糊狀)，應用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結構松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養后，細胞容易貼壁生長。
Ⅰ 酶消化分離法
酶消化分離法常采用*(Corning 25-053-CI)和膠原酶(Sigma/Life)
*分散原理：*是一種胰臟制品，對蛋白質有水介作用，主要作用于賴氨酸或*相連接的肽鍵，使細胞間質中的蛋白質水介而使細胞分散開。
影響*作用的主要因素：
細胞類型、酶的活力、酶的濃度、溫度、pH、無機鹽離子、消化時間
膠原酶(Collagenase，Sigma)消化法
膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細胞間質有較好的消化作用。

Ⅱ 非酶消化法(EDTA消化法)
EDTA是一種非酶消化物，又稱螯合劑或Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學物質能與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物，利用結合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或使貼壁細胞從瓶壁上脫離。
Ⅲ 消化分離法的操作步驟
剪切.加液漂洗.消化.棄去消化液.漂洗.機械分散
Ⅳ 消化分離法的注意事項
組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對*和EDTA的抑制作用。
胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。
消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產生，而且動作要輕，避免膨松的細胞隨漂洗而丟失。

3、原代細胞的培養和維持
(1)原代細胞的培養方法
原代細胞的培養也叫初代培養是從供體取得組織細胞在體外進行的培養，是建立細胞系的*步，是一項基本技術。
原代細胞zui接近和zui能反映體內生長特性，適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等實驗研究。
① 組織塊培養法
組織塊培養是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養方法。其基本方法是將剪成的小組織團塊接種于培養瓶(或皿)中，瓶壁可預先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細胞能沿瓶壁向外生長。
② 消化培養法
③ 懸浮細胞培養法
對于懸浮生長的細胞，如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養，或經淋巴細胞分層液分離后接種培養。
④器官培養
器官培養是指從供體取得器官或組織塊后，不進行組織分離而直接在體外的特定環境條件下培養，器官培養可保持器官組織的相對完整性，可用于重點觀察細胞間的、排列情況和相互影響，以及局部環境的生物調節作用。

(2)原代細胞的培養條件
① 靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養)培養
a 細胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性
b 細胞接種時濃度要稍大一些，至少為5×108細胞/L。
c 培養基可用Eagle(MEM Corning 10-010-CVR)或DMEM(Corning 10-013-CVR)培養。
d 胎牛血清濃度為10%-80%。
e 應在37℃5% CO2的培養箱中培養。。
f 在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細胞發生脫落，漂浮。
g 待細胞基本貼壁伸展并逐漸形成網狀，應將原代細胞換液
h 用骨髓或外周血中的懸浮細胞經靜置培養1周時，應將細胞懸液經低速離心后換液。

② 懸浮細胞的培養要求
a 原代培養時要盡量去除紅細胞
b 短期培養，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養基中進行
c 細胞濃度可在5-8×109/L范圍內，進行分瓶試驗。
d *培養時，淋巴細胞中要加入生長因子，白血病細胞中要加入少量的原患者血清，以利細胞生長。
f 細胞換液一般每隔3天需半量換液一次
g 腫瘤細胞傳代一般待細胞增殖加快、細胞密度較高時才能進行。