鴨胚胎肝間質細胞永生化培養步驟

鴨胚胎肝間質細胞永生化介紹

間充質干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是來源于早期中胚層的一類多能干細胞, 在體內具有分布廣泛, 體外能夠大量擴增和免疫原性低等特點, 是一種細胞治療的理想種子細胞。自20世紀60年代，Friedenstein等發現在人骨髓*培養中, 存在一種形態類似成纖維細胞的貼壁生長的細胞且移植到小鼠體內具有成骨能力和造血支持作用, 將這種細胞命名為骨髓基質細胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)。到20世紀90年代末, 人們才成功分離一種具有成骨、成軟骨和成脂肪能力的細胞, 稱之為間充質干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)。

隨后研究者也從其他組織, 如脂肪、臍帶、胎盤、肝臟、骨實質和肌肉等中成功分離獲得間充質干細胞。作為一類成體干細胞中的間充質干細胞, 目前大部分的研究集中在人及大鼠、小鼠這兩種模式動物上, 其他動物的間充質干細胞報道相對較少。選取中國*家禽品種鴨子為實驗材料, 以鴨胚胎肝臟中的間充質干細胞為研究對象, 對其進行分離培養鑒定, 進行增殖能力檢測及分化能力鑒定, 為家禽干細胞研究及畜禽遺傳資源保存提供借鑒及參考。鴨胚胎肝間質細胞進行慢病毒轉染8-12h，連續傳13代，采用高濃度含嘌呤霉素培養基（4μg/mL）培養，篩選陽性克隆；篩選出陽性永生化鴨胚胎肝間質細胞。

細胞特性

1）  來源：上海中科院動物研究所

2）  含量：>5x105個/mL

3）  污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性

4）  規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

運輸和保存：可選擇干冰運輸及發送復蘇存活細胞方式：（1）干冰運輸，收到后立即轉入液氮凍存或直接復蘇；（2）存活細胞，收到后應繼續生長，傳代達到細胞生長狀態良好時，再進行凍存。具體操作見細胞培養步驟。

細胞用途：僅供科研使用。

鴨胚胎肝間質細胞永生化培養步驟

一．培養基及培養凍存條件準備：

1)      準備鴨胚胎肝臟間充質干細胞*培養基（dmem 高糖和F12培養基1：1搭配， 10%血清   ，1%雙抗    以及1％自己配置的間質細胞因子。）。

2)      培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。

3)      凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配，液氮儲存。

二．細胞處理：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，離心管加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4-5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入T25培養瓶中培養，補加培養基至6ml。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加2ml*培養基終止消化。

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，加1-2mL培養液后吹勻。

4. 將細胞懸液按1：2到1:5比例分到新的含6ml培養基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。

  下面T25瓶為例；

1．細胞凍存時，棄去培養基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml*，細胞變圓脫落后，加入2ml*培養基終止消化，可使用血球計數板計數。

2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至zui終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數目大于1X106個細胞凍存。

3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

注意事項：

1.收到細胞后，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們。

2.收到細胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養箱靜置2-4小時（視細胞密度而定）穩定細胞狀態。接著在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照（建議收細胞時就整體外觀拍一張照片，觀察培養基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細胞狀態，100*，200*各一張），觀察記錄細胞在運輸過程中是否有污染情況。作為我方進行銷售依據。

3.由于細胞狀態受環境、操作和運輸等多方面因素影響，故本公司只保證客戶收到細胞后一周內的細胞狀態，故客戶需要售后時需出示收到細胞的時間證明及客戶提供收貨時間和發現問題后客服人員溝通的時間證明，期間間隔時間不能大于7天。

4.鴨胚胎肝間質細胞永生化所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。