滲入法測定細胞周期的原理與操作步驟

一、原理

細胞周期指細胞一個世代所經(jīng)歷的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。

單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。

測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、細胞計數(shù)法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測定細胞周期的方法。

BrdU(5-溴脫氧*核苷)加入培養(yǎng)基后，可做為細胞DNA復制的原料，經(jīng)過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經(jīng)歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。

二、儀器、用品與試劑

1、儀器、用品：同常規(guī)細胞培養(yǎng)

2、試劑：BrdU(1.0mg/ml)，甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

三、操作步驟

1、細胞生長至指數(shù)期時，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使zui終濃度為10μg/ml。

2、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。

3、48小時后常規(guī)消化細胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。

4、常規(guī)染色體制片(見第三部分：染色體技術)。

5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。

6、棄去2×SSC液，流水沖洗。

7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。

8、鏡檢100個分裂相，計*、二、三、四細胞期分裂指數(shù)。

9、計算：

細胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小時)

附：(1)BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。

(2)2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉•2H2O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。

注意事項：BrdU溶液需要避光保存在 4℃冰箱，SSC溶液也需要4℃保存，可根據(jù)實驗需要分裝后高壓滅菌。