干細(xì)胞周期測(cè)定實(shí)驗(yàn)的用途

一、要求
1、熟悉干細(xì)胞周期的基本概念、原理，掌握實(shí)驗(yàn)操作的流程和方法。
2、觀察流式細(xì)胞儀檢測(cè)、分析細(xì)胞周期的各種峰形圖的意義。
3、了解細(xì)胞周期測(cè)定實(shí)驗(yàn)的用途。
二、原理
細(xì)胞周期是指從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的時(shí)間。細(xì)胞周期反映了細(xì)胞的增殖速度，周期越短說明細(xì)胞的增殖速度越快。測(cè)定細(xì)胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞儀測(cè)定法等。流式細(xì)胞儀測(cè)定法是利用溴化乙錠（PI）滲入測(cè)定細(xì)胞周期的方法。溴化乙錠加入培養(yǎng)基后，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過兩個(gè)細(xì)胞周期后，細(xì)胞中兩條單鏈均含溴化乙錠的DNA將占l/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個(gè)周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個(gè)周期，則兩條單體均深染。計(jì)分裂相中各期比例，就可算出細(xì)胞周期的值。
三、材料
1、秋水仙素。
2、溴化乙錠（1.0mg/ml）。
3、無水乙醇。
4、RPMI1640*培養(yǎng)基。
5、RNase A (1mg/mL)。
6、PBS。
7、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。
8、離心機(jī)。
9、流式細(xì)胞儀。
10、細(xì)胞培養(yǎng)箱。
四、方法
1、取1×106對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整好細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。
2、離心收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗滌兩次。
3、加入預(yù)冷70％乙醇0.5ml，于4℃固定30分鐘。
4、離心收集細(xì)胞，取1mL PBS洗滌一次，加入0.2ml反應(yīng)液(含50靏/mL溴化乙錠，100靏/mL RNase A和0.2% Triton X-100 的PBS)，4℃避光孵育30分鐘。
5、PBS洗滌兩次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。
五、干細(xì)胞注意事項(xiàng)
1、實(shí)驗(yàn)操作過程中動(dòng)作要盡量輕柔，不可用力打碎細(xì)胞。
2、RNA酶現(xiàn)加，以*去除細(xì)胞中RNA的干擾。
3、溴化乙錠是光敏物質(zhì)，操作過程中注意避光。
4、zui后一步的洗滌應(yīng)盡量棄凈上清，以免游離PI殘留影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
17429-69-5    Astragaloside    20mg/支    黃芪總皂苷
84687-43-4    Astragaloside IV    20mg/支    黃芪甲苷
84680-75-1    Astragaloside I    10mg/支    黃芪皂苷I
84676-89-1    Astragaloside II    10mg/支    黃芪皂苷II
84687-42-3    Astragaloside III    10mg/支    黃芪皂苷III
97-53-0    Eugenol    0.5ml/支    *
860-79-7    Cyclovirobuxine    20mg/支    黃楊堿
10338-51-9    Salidroside    20mg/支    紅景天苷
干細(xì)胞
84954-93-8    Rosarin    20mg/支    絡(luò)塞琳
84954-92-7    Rosavin    20mg/支    絡(luò)塞維
85026-55-7    Rosin    20mg/支    絡(luò)緦
100462-37-1    Rosiridin    20mg/支    絡(luò)塞定