Caspase-3活性的檢測技術分析

Caspase家族在介導人源細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基(17KD)和兩個小亞基(12KD)組成，裂解相應的胞漿胞核底物，zui終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。

1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]等的裂解。

方法：

收集細胞→PBS洗滌→抽提人源細胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉移→5%脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2h或4°C過夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反應1~2h或4°C過夜→TBS-T(含0.05% Tween 20的TBS)洗3次，5~10min/次→HRP-標記的羊抗鼠IgG或AP標記的羊抗鼠IgG室溫反應1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL顯影或NBT/BCIP顯色。

結果：

2 熒光分光光度計分析

原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據這一特點，設計出熒光物質偶聯的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯時，AMC不能被激發熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發發射熒光。根據釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。

方法：收獲細胞正常或凋亡細胞?PBS洗滌?制備細胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC(caspase-3四肽熒光底物)?37°C反應1h?熒光分光光度計(Polarstar)分析熒光強度(激發光波長380nm，發射光波長為430-460nm)。

結果：

3 流式細胞術分析

方法：收獲細胞正常或凋亡細胞?PBS洗滌?加Ac-DEVD-AMC?37°C反應1h?UV流式細胞計分析caspase-3陽性人源細胞數和平均熒光強度。