在ELISA試劑盒免疫酶技術中，首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化，便可導致試驗結果產生很大的波動。另外，由于濃度過高，可使非特異性反應增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。
將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上，然后將經過一系列稀釋的酶標抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應，以酶與底物的顯色反應程度來確定酶標記抗體的效價，或稱工作濃度。
其步驟為：先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔內加0.1ml，4℃隔夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根據據抗體的滴度而定)，分別加入反應孔中，每個稀釋度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分鐘。以2M H2SO4 0.05ml終止反應。
結果判定主要以ELISA試劑盒比色儀讀取各孔OD值。并以OD為縱座標，結合物濃度為橫座標，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率zui大時的酶標抗體稀釋度，即為該標記物的工作濃度。
有關試驗的試劑及器材均見ELISA試劑盒部分。
C要說明的是，本法為ELISA試劑盒直接法，所測的工作濃度與在實際應用中的zui適濃度可相差幾個滴度。這就要求在建立ELISA試劑盒實驗系統中，因此基礎上還應進一步確定實際工作濃度(可采用方陣法)，以達到zui適的實驗條件。
注意事項
1. 在具備高質量HRP的條件下，所要標記的抗體也要活性高,效價高(zui低1∶16),純度高，親和力好，這是保證標記物效價高，免疫活性好的首要條件。"
2. 所使用ELISA試劑盒的PH和濃度及用量必須嚴格掌握。所用試劑，(或必需)新鮮配制。如在戊二醛標記法中所用戊二醛應為新鮮純品，因戊二醛儲存過久可形成縮和體(雜質)。否則，影響標記效果。
3. 室溫攪拌時須避光，室內溫度一般在25℃為宜。標記物每次透析前，須認真檢查，防止漏液。
4. ELISA試劑盒濃的標記物相當穩定，常加入30～40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀釋成1∶10，只能保存數周。ELISA試劑盒已配制的使用液應在12小時內用完。切忌反復凍融。
