1、 蝦白尾病（WTD）熒光 RT-PCR 檢測試劑盒（XSV）簡介
貨號：HB-810-2
蝦白尾病（White tail disease，WTD）也稱為白肌肉病（White muscle disease，WMD）或羅
氏沼蝦肌肉白濁病（Macrobrachium rosenbergii Whitish muscle disease）,主要在亞洲和南美洲
北部流行。其主要病原為羅氏沼蝦野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus，MrNV），
研究發(fā)現(xiàn)感染對蝦中還存在另外一種超小型病毒（Extra small virus，XSV），為 MrNV 的微型病毒。
蝦感染后腹部、尾部出現(xiàn)白色渾濁，zui終可擴(kuò)散全身肌肉，死亡率可達(dá) 95%以上。
為了適應(yīng)蝦白尾病快速檢測和疫病研究的需要，本公司參考 2016 年 OIE 水生動物疾病診斷手冊
2.2.7 中*的的引物和探針序列，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)及系統(tǒng)優(yōu)化，開發(fā)生產(chǎn)了本試劑盒。應(yīng)用本試劑盒
進(jìn)行檢測具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、安全操作簡單、應(yīng)用廣泛和高通量檢測等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)。
2、 試劑盒組成
試劑盒組成包括核酸擴(kuò)增試劑。具體組成參見表 1：
表 1：試劑盒組成（50test/盒）
試劑盒組成成分 體積
*： 核酸裂解液 15ml×2 管
核酸擴(kuò)增試劑： DEPC 水
WTD-XSV熒光RT-PCR反應(yīng)液
酶混合物
陰性對照
WTD-XSV 熒光陽性對照
1ml×1 管
750µL×1 管
60µL×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
（注：*可使用本公司生產(chǎn)的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》）
3、 樣本采集,存放及運(yùn)輸
3.1 樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干。隨機(jī)取5只-10只新鮮的蝦作為采樣標(biāo)本，采
集的部位包括：蝦頭部的眼柄、肝胰腺、頭腹部肌肉或腹肢等（可部分或全部采集這些組織）。詳
見相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。
3.2 存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；-70 ℃以下可*保存，但應(yīng)避
免反復(fù)凍融（zui多凍融 3 次）。
3.3 運(yùn)輸：采用泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。
4、 熒光 RT-PCR 檢測
4.1 操作方法
4.1.1 樣本的處理（在樣本制備區(qū)進(jìn)行）：
4.1.1.1 取 n 個滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，其中 n 為被檢樣品與陰性對照的和（陽性對照、陰性對照在試劑盒中已標(biāo)出），做標(biāo)記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需
提取核酸)
4.1.1.2 蝦白尾病（WTD）熒光 RT-PCR 檢測試劑盒（XSV）每管加入 600 ?L 裂解液，分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 ?L，一份樣本換用一個吸頭，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可以用
手顛倒混勻），于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。
4.1.1.3 取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，加入 500 ?L 異丙醇（-20℃預(yù)冷），
做標(biāo)記。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，上清液應(yīng)至少吸取 500?L，不能吸
出中間層，顛倒混勻。
4.1.1.4 于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），小
心倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；加入 600 ?L 75％
乙醇，顛倒洗滌。
4.1.1.5 于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），小
心倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）。
4.1.1.6 4 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），將管壁上的殘余
液體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不要
碰到有沉淀一面，室溫干燥 3 min，不能過于干燥，以免 RNA 不溶。
4.1.1.7 加入 11 ?L DEPC 水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存?zhèn)?br />用。提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。
【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書》（貨號：HB-QPCR-01）使用，更方便快捷提取
核酸】。
注：提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。
4.1.2 檢測
4.1.2.1 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：
從試劑盒中取出相應(yīng)的熒光 RT-PCR 反應(yīng)液、酶混合物，在室溫下融化后，2000 r/min 離心 5 s。
設(shè)所需熒光 RT-PCR 檢測總數(shù)為 n，其中 n 為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和，每個樣品測試反
應(yīng)體系配制見表 2：
表 2 每個樣品測試反應(yīng)體系配制表
試劑 RT-PCR 反應(yīng)液 酶混合物
用量 15 μL 1.0 μL
根據(jù)測試樣品的數(shù)量計(jì)算好各試劑的使用量，加入到適當(dāng)體積試管中，充分混合均勻，向每個
熒光RT-PCR管中各分裝16 ?L，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
4.1.2.2 加樣（樣本處理區(qū)進(jìn)行）：
在各設(shè)定的熒光RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10 ?L，蓋緊
管蓋，500 r/min離心30 s。
4.1.2.3 熒光 RT-PCR 檢測（在檢測區(qū)進(jìn)行）：
將4.1.2.2中離心后的PCR管放入熒光RT-PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。
循環(huán)條件設(shè)置：
*階段：42oC /60 min；
第二階段：95oC /10 min；
第三階段：95oC /15 sec, 58 oC /30 sec，40個循環(huán)，在58 o
C的退火延伸時收集熒光。
試驗(yàn)檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。
注：本試劑盒采用Eva Green熒光染料標(biāo)記，熒光波長與SYBR Green相近，進(jìn)行檢測時選取SYBR Green染料法即可！
4.2 結(jié)果判定
4.2.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
直接讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣
品擴(kuò)增曲線的zui高點(diǎn)為準(zhǔn)。
4.2.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
4.2.2.1 陰性對照無 Ct 值或無擴(kuò)增曲線。
4.2.2.2 陽性對照的 Ct 值應(yīng)<25.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無效。
4.2.3 結(jié)果描述及判定
4.2.3.1 陰性
無Ct值或無擴(kuò)增曲線，示樣品中無待檢病原核酸。
4.2.3.2 陽性
Ct值≤30，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，示樣品中存在待檢病原核酸。
4.2.3.3 蝦白尾病（WTD）熒光 RT-PCR 檢測試劑盒（XSV）有效原則
Ct值>30的樣本建議重做。重做結(jié)果無數(shù)值者或仍大于30為陰性，否則為陽性。
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