干細(xì)胞實(shí)體組織材料的分離方法

干細(xì)胞對于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。
（一）   機(jī)械分散法
所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細(xì)胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)（用九號針），使細(xì)胞通過針頭壓出，或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠（常用注射器鈍端）使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細(xì)胞雖然簡便、快速，但對組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。
 
（二）消化分離法   組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機(jī)械
法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。
 1、酶消化分離法  
酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶，其分離方法如下：
（1） 胰蛋白酶分散技術(shù)  
 
胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應(yīng)用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開，在常
用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同，對細(xì)胞的消化能力也不同，胰蛋白酶對細(xì)胞的作用，取決于細(xì)胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機(jī)鹽離子、pH以及消化時間的長短
等。 
 ①細(xì)胞類型 胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織,能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結(jié)締組織較豐富的組織,如滑膜、子宮、纖維肉瘤
、腫瘤組織等就無效，但若與膠原酶合用,就能增加其對組織的分離作用。
 ②酶的活力 市售的胰蛋白酶,其活力都經(jīng)過測定而有效，但配制時必須新鮮，需保存在低溫冰箱中，消化時的pH和溫度都要適宜，否則會影響活力，細(xì)胞的分散直接與酶的活力有關(guān)，Z終使用活力為1:200或1:250，56℃pH8.0時活力Z強(qiáng)。該酶為粉劑，保藏時要防潮，室內(nèi)溫度不宜過高，保存時間不能太長，若粉劑結(jié)團(tuán)塊,說明該部分受潮或失效。 
③酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%（活力1:200或1:250）,但遇到難消化的組織時，濃度可適當(dāng)提高，消化時間適當(dāng)延長。濃度高對細(xì)胞有毒性，而較低濃度的胰蛋白酶在培養(yǎng)液中可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，若培養(yǎng)液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。  
④溫度 一般認(rèn)為胰蛋白酶在56℃時活性Z強(qiáng)，但由于對細(xì)胞有損害而不能被采用，常使用的溫度為37℃，通常在37℃進(jìn)行消化比室溫作用快。  
⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少，活性強(qiáng)分散快，干細(xì)胞也容易被消化下來，消化分離細(xì)胞時PH只能選用7.6～8.0之間，否則對細(xì)胞有損傷。  
⑥無機(jī)鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來配制胰蛋白酶時，可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制時應(yīng)采用無鈣鎂離子的PBS配制。
⑦消化時間 如果細(xì)胞消化時間過長，可以損害細(xì)胞的呼吸酶，從而影響細(xì)胞的代謝，一般消化時間為20分鐘為宜，冷消化時使用低濃度消化液，于4℃也可。 
Norethindrone Acetate     炔諾酮醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)品    51-98-9     100mg
Mefloquine Hydrochloride     鹽酸甲氟喹標(biāo)準(zhǔn)品    51773-92-3     100mg
Diatrizoic Acid    泛影酸標(biāo)準(zhǔn)品    50978-11-5    100mg
Hexacosanol    二十六碳醇標(biāo)準(zhǔn)品    506-52-5     100mg
Estriol    雌三醇標(biāo)準(zhǔn)品    50-27-1    100mg
Erythrosine Sodium    四碘熒光素鈉標(biāo)準(zhǔn)品    49746-10-3    100mg
Rimexolone    瑞美松龍標(biāo)準(zhǔn)品    49697-38-3     100mg
Metronidazole     甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品    443-48-1     100mg
    奧昔布寧相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品    4335-77-7     100mg
Fenbendazole     苯硫咪唑標(biāo)準(zhǔn)品    43210-67-9     100mg
干細(xì)胞