健康原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備及步驟

① 從健康原代細(xì)胞開始
Ⅰ 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前，細(xì)胞解凍后傳代3–4次。 這使得細(xì)胞從解凍過程中恢復(fù)過來，并恢復(fù)正常的生長速度。
Ⅱ 僅使用活性 >90%的細(xì)胞——使用臺(tái)盼藍(lán)染色可輕松測定細(xì)胞活性。
Ⅲ 定期傳代細(xì)胞，切勿讓細(xì)胞長到匯合狀態(tài)或過度生長。如果讓細(xì)胞長到匯合狀態(tài)，可能會(huì)改變細(xì)胞的生長速度以及形態(tài)。
a. 請(qǐng)?jiān)趨R合率達(dá)到90%之前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。我們建議您使用胰酶替代物Cellstripper™試劑(Corning 25-056-CI)使細(xì)胞脫壁。Cellstripper™試劑可于室溫下存儲(chǔ)在通風(fēng)櫥中。可通過添加過量的Cellstripper™來跳過PBS洗滌的步驟，然后吸棄全部液體，僅留可覆蓋瓶子表面的液體。
* 非酶類細(xì)胞分離溶液，其配方是螯合劑的配方，可溫和分離組織培養(yǎng)物的貼壁細(xì)胞。性質(zhì)比胰酶更溫和。
b. 傳代條件取決于所用的細(xì)胞系。 部分經(jīng)驗(yàn)法則：
對(duì)于快速生長的細(xì)胞，倍增時(shí)間為16小時(shí)(如HEK-293)，按1：10的比例分瓶。
對(duì)于生長緩慢的細(xì)胞，倍增時(shí)間為36小時(shí)(如原代細(xì)胞)，按1：5的比例分瓶。
Ⅳ 保留凍存的細(xì)胞系，并定期解凍新細(xì)胞。 傳代次(>30–40)時(shí)，細(xì)胞的生長速度和形態(tài)會(huì)改變。

② 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，請(qǐng)先規(guī)劃您的實(shí)驗(yàn)。
務(wù)必要熟悉實(shí)驗(yàn)方案、確定所需的材料量，并在開始實(shí)驗(yàn)前確認(rèn)所需的一切物品條件均已齊備。
Ⅰ 開始前，設(shè)計(jì)好鋪板路線圖，標(biāo)注好每次處理或?qū)嶒?yàn)條件。
Ⅱ 計(jì)算所需脂質(zhì)體和DNA的儲(chǔ)備量，并確認(rèn)有足夠的下列材料：TransfectGRO減血清培養(yǎng)基(Corning 40-300-CVR)，Lipofectamine® 2000 或Lipofectamine® LTX試劑，以及DNA (0.5–1 µg/µL)。

③ 轉(zhuǎn)染時(shí)，請(qǐng)使用DNA。
Ⅰ 使用無內(nèi)毒素的試劑盒和實(shí)驗(yàn)方案制備DNA。
Ⅱ 通過測量OD 260/280值來確定DNA純度，測得的OD值應(yīng)介于1.7–1.9]之間。數(shù)值過高或過低均說明有雜質(zhì)，不宜用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
Ⅲ 在無DNA/RNA酶的水或TE中稀釋DNA。
Ⅳ 制備的工作濃度為0.5–1 µg/µL。 可用SpeedVac®濃縮儀或透析過濾裝置(例如，Millipore Amicon®超濾管)來濃縮DNA。

④ 轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將細(xì)胞鋪板。
Ⅰ 如果在轉(zhuǎn)染前一天或更早時(shí)間鋪板，轉(zhuǎn)染效率可能下降。
Ⅱ 轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞密度保持在匯合率為70–90%。
Ⅲ 轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞密度影響轉(zhuǎn)染效率。 為了簡化轉(zhuǎn)染優(yōu)化過程或節(jié)省時(shí)間，我們建議細(xì)胞鋪成2種不同的密度，以確保較高的轉(zhuǎn)染效率。
Ⅳ 細(xì)胞的鋪板和轉(zhuǎn)染可同時(shí)進(jìn)行，或者通過反向轉(zhuǎn)染操作進(jìn)行。 反向轉(zhuǎn)染操作中，使用的細(xì)胞是正常/正向轉(zhuǎn)染的2.5倍以上。
Ⅴ 轉(zhuǎn)染復(fù)合物可以加到含抗生素和血清的培養(yǎng)基中，且不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。

⑤ 準(zhǔn)備脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。
Ⅰ 為了獲得試驗(yàn)結(jié)果，我們建議在TransfectGRO培養(yǎng)基中混合脂質(zhì)體和DNA。 另一種方法是使用無血清培養(yǎng)基。
Ⅱ 在TransfectGRO培養(yǎng)基中稀釋脂質(zhì)體。 在第二管Opti-MEM®培養(yǎng)基中稀釋DNA，然后和等體積脂質(zhì)體溶液混合。 該2步稀釋法可獲得更的數(shù)據(jù)，比脂質(zhì)體直接加入稀釋的DNA中的方法獲得的結(jié)果更有重復(fù)性。
Ⅲ 脂質(zhì)體一旦在TransfectGRO培養(yǎng)基中稀釋，在加入稀釋的DNA之前，孵育時(shí)間為2- 5分鐘。 稀釋的脂質(zhì)體孵育時(shí)間不要超過20]分鐘。
Ⅳ DNA的TransfectGRO溶液更加穩(wěn)定，Z早可以提前4小時(shí)制備，但不要太早。
Ⅴ 原代細(xì)胞等體積稀釋的脂質(zhì)體和DNA溶液等體積混在一起后，通過緩慢地上下吹打來混合溶液，也可輕彈試管底部，或者快速渦旋混合。
Ⅵ 脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物溫育5-10小時(shí)后，將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到含有細(xì)胞和生長培養(yǎng)基的孔中。 將復(fù)合物滴加到培養(yǎng)基上，然后輕輕地晃動(dòng)板子。 切勿劇烈地將孔中的脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物分散，否則會(huì)使細(xì)胞移位。
130573-200701    50mg    鑒別
130576-200901    50mg    有關(guān)物質(zhì)
130579-200901    100mg    有關(guān)物質(zhì)
130585-201001    100mg    HPLC含量
130593-200901    200mg    HPLC含量
130601-201001    50mg    有關(guān)物質(zhì)
130605-201001    50mg    有關(guān)物質(zhì)
130650-200901    50mg    有關(guān)物質(zhì)
135001-201002    11.9g/400ml    培養(yǎng)基適應(yīng)性
135002-201002    11.4g/400ml    培養(yǎng)基適應(yīng)性
135003-201002    9.0g/400ml    培養(yǎng)基適應(yīng)性
原代細(xì)胞