原代細(xì)胞凍存和復(fù)蘇操作規(guī)程

原代細(xì)胞培養(yǎng)的傳代及日常維持過(guò)程中，在培養(yǎng)器具、培養(yǎng)液及各種準(zhǔn)備工作方面都需大量的耗費(fèi)，而且細(xì)胞一旦離開(kāi)活體開(kāi)始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存十分必要。細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中，溫度達(dá)-196℃，理論上儲(chǔ)存時(shí)間是無(wú)限的。
原理 ：
細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以Z大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。
主體內(nèi)容（操作步驟）：
一、材料
（一）儀器
1. 凈化工作臺(tái)
2. 離心機(jī)
3. 恒溫水浴箱
4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
5. 倒置相差顯微鏡
6. 培養(yǎng)箱
7. 液氮冰箱
（二）玻璃器皿
1. 吸管（彎頭、直頭）
2. 培養(yǎng)瓶
3. 玻璃瓶（250ml、100ml）
4. 廢液缸
（三）塑料器皿
1. 吸頭
2. 槍頭
3. 膠塞
4. 移液管（10ml）
5. 15ml離心管
6. 凍存管（1～2ml）
（四）其他物品
1. 微量加樣槍
2. 紅血球計(jì)數(shù)板
3. 記號(hào)筆
4. 醫(yī)用橡皮膏
5. 移液槍
（五）試劑
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. 培養(yǎng)液
4. 雙抗（青霉素、鏈霉素）
5. 胰蛋白酶（0.08%）
6. 1NHCl
7. 7.4%NaHCO3
8. DMSO（分析純）或無(wú)色新鮮甘油
四、操作步驟
（一）細(xì)胞凍存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液；
2. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)，懸浮生長(zhǎng)的原代細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管中、；
3. 離心1000rpm，5min；
4. 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的Z終密度為5×106/ml～1×107/ml；
5. 將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；
6. 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱(chēng)，凍存時(shí)間及操作者；
7. 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中過(guò)夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。
（二） 細(xì)胞復(fù)蘇
1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。
2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開(kāi)蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻；
3. 離心， 1000rpm，5min；
4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；
5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
五、注意事項(xiàng)
1．從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液；
2．將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，以免凍傷；
3．原代細(xì)胞凍存和復(fù)蘇用新配制的培養(yǎng)液。