ATCC細(xì)胞的分離技術(shù)-尼龍毛法

（一）ATCC細(xì)胞原理 
混合單個核細(xì)胞懸液在通過尼龍毛柱時，B細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞和一些輔助細(xì)胞被選擇性粘附于尼龍毛上，而多數(shù)T細(xì)胞則通過尼龍毛柱，這是獲得富含T細(xì)胞群的有效方法。

（二）材料及試劑
1．尼龍毛（ Nylon Wool Fiber）。
2．燒杯、鋁箔、漏斗、一次性手套等。
3．裝填尼龍毛柱，一次性注射器。
4．取自然沉降的上層血漿，過聚蔗糖—泛影葡胺分層液后，獲取的血漿和分層液之間的單個核細(xì)胞層。

（三）操作方法 
1．尼龍毛的清洗與干燥
（1）戴上已經(jīng)洗去滑石粉的一次性手套，將尼龍毛（1包或2包，每包35g）放入燒杯中，加入蒸餾水或去離子水，用鋁箔蓋上燒杯并煮沸約10min。
（2）冷卻至常溫，倒入漏斗內(nèi)，使水滴干。
（3）重復(fù)（1）、（2）步驟6次。
（4）將尼龍毛攤在鋪有紗布的方盤內(nèi)，37℃溫箱干燥2～3天后，貯藏在帶蓋的方盤內(nèi)。

2．裝尼龍毛柱
（1）取50ml玻璃注射器，拔去注射芯，在注射器頭上套一段帶夾子的膠管。
（2）將尼龍毛梳理，并適當(dāng)折疊，以適應(yīng)注射器的直徑，填入注射器內(nèi)，約20ml的體積。
（3）將填好尼龍毛的注射器連同注射器芯一起包好，高壓滅菌。

3．細(xì)胞分離
（1）將注射器固定在支架上，倒入37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液，關(guān)閉閥門一定時間，然后打開閥門，放掉細(xì)胞培養(yǎng)液，以清洗幾次尼龍毛，關(guān)上閥門。
（2）將要分離的細(xì)胞液用預(yù)先加溫的培養(yǎng)液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛龋s5.00×107個細(xì)胞／ml。
（3）將細(xì)胞液倒入注射器內(nèi)，使之沒過尼龍毛柱。蓋上注射器，37℃溫育45min
至1h。
（4）打開下口，緩慢放流（1滴／min），收集于離心管中。
（5）離心，即獲所需的T淋巴細(xì)胞。
（6）關(guān)閉注射器下口，于注射器內(nèi)加入0.85％冰冷生理鹽水，振蕩，并套上注射器芯，打開下口，使勁推出注射器內(nèi)液體，即獲得粘附于尼龍毛上的B淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。

（四）ATCC細(xì)胞注意事項
1．此種分離法，T淋巴細(xì)胞也常有一部分被吸附，吸附的多少與尼龍毛的質(zhì)量有關(guān)，與裝柱的松緊也有關(guān)系。
2．此法的T淋巴細(xì)胞的回收率約20％～30％。
3．用過的尼龍毛可回收，以鹽水洗滌，然后浸入0.1Mol/L的HCl中過夜，然后再同前法清洗。
鹽酸水蘇堿    含量測定    對照品    20mg
鹽酸小檗堿    含量測定    對照品    30mg
黃芩苷    含量測定    對照品    40mg
靛藍(lán)    鑒別    對照品    30mg
靛玉紅    含量測定    對照品    30mg
酯蟾毒配基    含量測定    對照品    20mg
麝香酮    GC含量測定    對照品    0.15ml
橙皮苷    含量測定    對照品    20mg
柚皮苷    含量測定    對照品    20mg
甘草次酸    含量測定    對照品    20mg
ATCC細(xì)胞