原代細胞傳代培養的操作介紹

1.觀察培養基是否正常，原代細胞狀態如何，細胞密度如何，決定是否傳代。觀察時擰緊蓋子。
2.加熱PBS、versene、培養基，(提前做好) 瓶子不要倒著放，不要讓液體接觸到瓶塞。
3.打開超凈臺(先開風機，后開照明)，用75%乙醇清潔臺面，點燃酒精燈。不要把廢液缸拿出去倒，如果廢液太多，可以用其他容器先裝廢液。取小離心管一個，置于架子上。
4.取尖吸管、吸量管各一支，放置在的架上。放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要與架子接觸。
5.取待傳代的細胞。打開versene，用酒精燈外焰燒。燒吸管時距離酒精燈心遠些，不要把渣滓帶進去。把試劑拿入臺子的時候，盡量平穩，不要讓試劑碰到瓶口。
6.用吸量管吸取舊的培養基，置離心管中，吸量管加入versene，然后將versene瓶收起來。(加versene主要是為了將舊培養基洗去)。在離心管中間部分將液體加入。吸液體和加液體時都不要對著細胞。
7.打開胰酶，然后將versene棄掉。換新管，用尖吸管吸取適量胰酶加入。加胰酶后，盡快放平，使原代細胞消化時間一致。
8.將細胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶，打開PBS. 之后拿出來鏡下隨時觀察。使用二次消化法，去除容器中殘余的細胞。別忘了用舊培養基中和。
9.取細胞，鏡下觀察消化情況。消化程度合適之后(細胞變圓，但不漂起)，用尖吸管棄去胰酶，取離心管中的培養基加入細胞，吹打，至所有細胞從培養皿底部脫落下來。用PBS洗細胞，versene對細胞有毒性，且不能被血清中和。然后吸取至離心管中，800 rpm離心5分鐘。
10.吸量管吸取適量培養基加入新的培養皿中。
11.細胞離心畢，用吸新培養基的管棄去上清，先把泡沫吸走。換吸量管吸取培養皿中培養基適量，加入離心管，小體積混勻，將細胞重懸，尖吸管吹勻。
12.擦計數板，用槍吸10ul的液體，計數。不要把槍伸到離心管內。
13.吸量管吸取原代細胞懸液，加入新的培養皿中。鏡下觀察，搖勻，放入37度孵育。收超凈臺。