急性肝胰腺壞死（AHPND）熒光 PCR 檢測試劑盒說明書

1、 急性肝胰腺壞死(AHPND)熒光PCR檢測試劑盒簡介 
貨號：HB-809-3 
為了適應(yīng)蝦急性肝胰腺壞死(AHPND)快速檢測和疫病研究的需要，本公司根據(jù) OIE 手冊中提供的
參考序列和信息并在其基礎(chǔ)上優(yōu)化改進，開發(fā)生產(chǎn)了本試劑盒。應(yīng)用本試劑盒進行檢測具有快速、
靈敏、特異、準確、安全操作簡單、應(yīng)用廣泛和高通量檢測等特點及優(yōu)點。
2、試劑盒組成 
試劑盒組成包括核酸提取試劑和核酸擴增試劑，具體組成參見表 1：
表 1：試劑盒組成（50test/盒）
組成成分 體積
樣品 DNA 提取液 1
樣品 DNA 提取液 2
5ml×1 管
500µl×1 管
核酸擴增試劑： DEPC 水
AHPND 熒光 PCR 反應(yīng)液
Taq 酶(5U/ul)
陰性對照
AHPND 熒光陽性對照
5ml×1 管
750µl×1 管
40µl×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
*保存條件：樣品 DNA 提取液 1、2 和試劑盒須在-20℃保存。 
3、樣本采集，存放及運輸 
3.1 樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干。取組織標記后置于離心管中，按照試劑盒配套的DNA 抽提試劑操作說明提取DNA模板。
3.2存放：研磨后的樣本在2 ℃-8 ℃條件下保存應(yīng)不超過24 h；-70 ℃以下可長期保存，但應(yīng)避免反復凍融（多凍融3次）。
3.3 運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸。 
4、檢測步驟 
4.1 DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進行)： 
4.1.1 取 n 個 1.5ml 滅菌 Eppendorf 管，其中 n 為待檢樣品數(shù)和一管陰性對照之和，對每個管進行編號標記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需提取核酸)
4.1.2 每管加入 100 µl DNA 提取液 1，然后分別加入待測樣本和陰性對照各 100µl，一份樣本換用一個吸頭；混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃～25℃條件下，12 000 r/min 離心 10 min。
4.1.3 盡可能吸棄上清且不碰沉淀，再加入 10µl DNA 提取液 2，混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃～25℃條件下，2 000 r/min 離心 10 s。
4.1.4 100℃ 干浴或沸水浴 10 min；加入 90µl DEPC 水，12 000 r/min 離心 10 min，吸取上清，
即為提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增或放置于-70℃冰箱內(nèi)保存）。
4.2 熒光 PCR 檢測 
4.2.1 急性肝胰腺壞死(AHPND)熒光PCR檢測試劑盒擴增試劑準備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進行）：
從試劑盒中取出相應(yīng)的熒光 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶，2000×g 離心 5 秒鐘。每個樣品測試反應(yīng)體系
配制見下表 2。
表 2 每個樣品測試反應(yīng)體系配制表
試劑 熒光 PCR 反應(yīng)液 Taq 酶 合計
用量 14.5 μL 0.5μL 15μL
4.2.2 加樣（樣本處理區(qū)進行）：
向每個熒光 PCR 管孔中各分裝 15μL 的混合液，再分別加入樣本 DNA 模板 10μL，蓋緊管蓋，
500 r/min 離心 30 s。
4.2.3 PCR 檢測（在檢測區(qū)進行）：
循環(huán)條件設(shè)置：
*階段，95℃/3 min；
第二階段，95℃/15 sec，60℃/1 min，40 個循環(huán)；在第二階段每次循環(huán)的退火延伸時收集熒
光。試驗檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和 Ct 值判定結(jié)果。
5、結(jié)果判定 
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
直接讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣
品擴增曲線的高點為準。
5.2 質(zhì)控標準
5.2.1 陰性對照無 Ct 值或無擴增曲線。
5.2.2 陽性對照的 Ct 值應(yīng)<25.0，并出現(xiàn)典型的擴增曲線。否則，此次實驗視為無效。
5.3 結(jié)果描述及判定
5.3.1 陰性：無Ct值或無擴增曲線，示樣品中無AHPND核酸。
5.3.2 陽性：Ct值≤30，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，示樣品中存在AHPND核酸。
5.3.3 有效原則：Ct>30的樣本建議重做。重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性，否則為陽性。
6、急性肝胰腺壞死(AHPND)熒光PCR檢測試劑盒相關(guān)技術(shù)信息 
F：TTGGACTGTCGAACCAAACG
R：GCACCCCATTGGTATTGAATG
probe： 5’-FAM-AGACAGCAAACATACACCTATCATCCCGGA-TAMRA-3’