人D二聚體（D2D）ELISA試劑盒實驗技術原理

人D二聚體（D2D）ELISA試劑盒實驗原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被人D二聚體（D2D）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人D二聚體（D2D）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。
樣本處理及要求
1.  血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2.  血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8°C 1000g離心20分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3.  組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4.  細胞培養物上清或其它生物標本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

標本處理
1.  本公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預留充足的樣本。
2.  實驗前應預測標本含量，如果標本濃度過高，應對標本進行稀釋，使稀釋后的標本符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。標本使用0.01mol/L的PBS稀釋(PH=7.0-7.2)。
3.  若所檢樣本不包含在說明書所列樣本之中，建議進行預實驗驗證其有效性，并注意留存樣本。
4.  使用化學裂解液制備的組織勻漿或細胞提取液可能會由于某些化學物質的引入導致ELISA實驗結果偏差。
5.  若樣本為細胞培養上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細胞狀態、細胞數量、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況。
6.  某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。
7.  建議使用新鮮樣本，保存時間過長可能會存在蛋白降解或變性導致實驗結果偏差。
 
需要而未提供的試劑和器材
酶標儀（450nm）
高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
37℃恒溫箱
蒸餾水或去離子水
備注：
1.  標準品濃度依次為：1600、800、400、200、100、0 ng/mL
2.  經過大量正常標本檢驗，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過大標準品濃度時，可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗。
 
人D二聚體（D2D）ELISA試劑盒注意事項
嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經變藍的底物液不能使用。
避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。
在儲存和溫育時避免強光直接照射。
平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。
不能使用過期產品。
如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。
 
試劑準備
試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
 
操作步驟
1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.  設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3.  樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.  除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.  每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。
 
實驗結果計算
以所測標準品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標，在坐標紙上或用相關軟件繪制標準曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。
 
試劑盒性能
1.  檢測范圍：50 ng/mL – 1600 ng/mL。
2.  靈敏度：低檢測濃度小于10 ng/mL。
3.  特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。
4.  重復性：板內變異系數小于10% ，板間變異系數小于15% 。
 
說明
1.  由于現有條件及科學技術水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產品可能存在一定的質量技術風險。
2.  終的實驗結果與試劑的有效性、實驗者的相關操作以及當時的實驗環境密切相關，請務必準備充足的標本備份。
3.  不同批次的同一產品可能會有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依據試劑盒內說明書進行實驗操作，電子版說明書僅作參考。
4.  人D二聚體（D2D）ELISA試劑盒只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產品。只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到的檢測結果。