豬細(xì)小病毒探針?lè)晒舛?PCR 試劑盒實(shí)驗(yàn)原理

豬細(xì)小病毒探針?lè)晒舛?PCR 試劑盒

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：豬細(xì)小病毒探針?lè)晒舛?PCR 試劑盒

Name ：Porcine Parvovirus (PPV) Probe qPCR Kit

【包裝規(guī)格】50 次/盒

【產(chǎn)品及特點(diǎn)】

豬細(xì)小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)會(huì)引起豬細(xì)小病毒病。這是一種豬繁殖

障礙病，該病主要表現(xiàn)為胚胎和胎兒的感染和死亡，特別是初產(chǎn)母豬發(fā)生死胎、畸

形胎和木乃伊胎，但母豬本身無(wú)明顯的癥狀。豬群暴發(fā)此病時(shí)常與窩仔數(shù)減少、母

豬難產(chǎn)和重復(fù)配種等臨床表現(xiàn)有關(guān)。在懷孕早期 30-50 天感染，胚胎死亡或被吸

收，使母豬不孕和不規(guī)則地反復(fù)發(fā)情，該病毒會(huì)給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因

此豬細(xì)小病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。本公司開發(fā)豬細(xì)

小病毒探針?lè)晒舛?PCR 試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2.引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏性高。

3.提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)豬細(xì)小病毒 DNA 高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他微生物 DNA

發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為 5 個(gè)數(shù)

量級(jí)

6.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針?lè)晒舛?PCR 反應(yīng)。

7.本產(chǎn)品只能用于科研。

【規(guī)格及成分】

成分 包裝

2×Probe qPCR Magic Mix 500 μL（紅蓋）

熒光 PCR 專用模板稀釋液 1 mL（綠蓋）

超純水 1ml（白蓋）

豬細(xì)小病毒探針?lè)?qPCR 引物-探針

混合液

150 μL（棕色蓋）

豬細(xì)小病毒探針?lè)?qPCR 陽(yáng)性對(duì)照

(1×10E7 拷貝/μL)

50 μL（黃蓋）

使用手冊(cè) 1 份

【運(yùn)輸及保存】

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

【自備試劑】

樣品 DNA。

【使用方法】

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）

由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污

染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原 本產(chǎn)品不

提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭下同）。

3.在 6 號(hào)管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分

鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充

分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充

分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個(gè)樣品待提取，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備

陽(yáng)性對(duì)照），和 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以取陽(yáng)性對(duì)照的 1000 倍稀釋液 10

μL 再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規(guī)定體積一致，以此作為 PC。另

外用水作為 NC。

8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)

用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用

于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其

中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模

板），1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面

只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完

畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

成分/每管

樣品管

N+2 個(gè)

PCR 陰

性對(duì)照管

標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品

管（1-6 管）

2×Probe qPCR Magic Mix 10 μL 10 μL 10 μL

豬細(xì)小病毒探針?lè)?qPCR 引物-探針

混合液

3 μL 3 μL 3 μL

N+2 個(gè)待測(cè) DNA 模板 7 μL - - 超純水 - 7 μL - 第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液

（1-6 號(hào)） - - 7 μL（1 號(hào)樣到

1 號(hào)管，2 號(hào)樣到

2 管…）

11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：

過(guò)程 溫度 時(shí)間

預(yù)變性 95℃ 10 min PCR 反應(yīng)

（45 個(gè)循環(huán)）

95℃ 15sec 55℃ 30sec 72℃ 40sec（采集 FAM 通道的熒光信號(hào)）

四、數(shù)據(jù)處理

12.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值

為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品核酸濃度

的 log 值，再推算出其濃度。

13.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于

或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等

于 35。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則

為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于

40 則為陰性，如果小于 40，則為陽(yáng)性。