酶免疫檢測技術分析方法

酶免疫檢測技術分析方法

1．標記抗原

(1)全酶標記抗原用于測定小分子化合物的酶有溶菌酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄糖一6一磷酸脫氫酶等，進口原裝elisa試劑盒通過雙功能交聯劑N一羥基丁二酰亞胺酯與抗原共價結合。

(2)輔基標記抗原 預先將葡萄糖氧化酶在酸性條件下水解成葡萄糖氧化酶蛋白和黃素腺嘌呤雙核甘酸(FAD)兩種成分，它們單獨存在時無酶活性，但可組成具有酶活性的葡萄糖氧化酶。試驗中，先將FAD標記到抗原分子上，當此標記試劑與抗體結合后，FAD即失去重組能力。

(3)輔酶標記抗原這是利用偶聯酶系統的反復增幅放大作用能檢測微量輔酶的特性而建立的一種超敏感方法。

(4)底物標記抗原 大都選用口半乳糖苷酶的熒光性底物——4一甲基傘形酮基β-D半乳糖苷(4MUG)標記抗原。

2．標記抗體

(1)標記抗體酶抑制免疫測定法 常用磷脂酶c與IgG抗體分子經水溶性羥化和亞胺共價交聯成酶標抗體，底物為SRBC(綿羊紅血細胞)壁中的磷脂物質。將待測樣品、酶標抗體和SRBC加在一起．當抗原抗體結合后可抑制標記抗體中的酶對SRBC壁中磷脂的水解能力，SRBC則不發生溶解。

(2)酶增強免疫測定法此法需兩種抗體試劑。首先在待測樣品中加入少量β-半乳糖苷酶標記的抗體．經抗體、抗原結合后，加入琥珀酰化的帶過量負電荷的抗體，與抗原發生第二次結合，使其表面的負電荷大大增強。當加入帶正電荷的小分子底物鄰硝基半乳糖吡喃苷時．由于靜電引力作用，在抗原分子周圍形成大量的酶底物結合物，經比濁(355nm)測定，可確定抗原含量。

(3)配對酶雙標記系統 配對酶亦稱偶聯酶，其中一種酶催化底物產生的物質正好是第二種酶的底物。

3．不均相酶免疫試驗

不均相酶免疫試驗是目前廣泛應用的方法。酶結合物直接與樣品中的抗原、半抗原或抗體進行免疫化學反應形成酶免疫復合物，它與游離的酶結合物在物質上或多或少是相同的．因此需將其分離后．進口原裝elisa試劑盒再進行酶的活性測定．并計算樣品中抗原、半抗原或抗體的含量。

(1)直接法將所選擇的酶通過適當的交聯劑．與特異抗體球蛋白，與相應抗原溫育，然后用該酶的特殊底物，顯示抗原一抗體復合物的存在。

(2)間接法抗原與相應抗體反應后．用酶標記的抗球蛋白溫育，然后用該酶的特殊底物．顯示抗原抗體復合物的存在。

(3)雙重抗體法將抗原的溶液與含特異性抗體的免疫球蛋白致敏載體表面溫育，洗去過剩的抗原溶液．然后加入酶標記的特異性抗體球蛋白，這種酶標記的抗體球蛋白吸附到已被致敏的載體表面所結合的抗體上。溫育后，洗去過剩的酶標記抗體球蛋白。使用特殊的底物顯示復合物的存在。 另外。進口原裝elisa試劑盒還有專門檢測抗原的標記抗原競爭法和不需要使酶與抗體或抗原交聯的不標記抗體酶方法。