ELISA原理與分類
一、ELISA的原理
ELISA的根底是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶符號。在固相載體外表的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶符號的抗原或抗體既保存其免疫學(xué)活性，又保存酶的活性。在測守時(shí)，受檢標(biāo)本（測定其間的抗體或抗原）與固相載體外表的抗原或抗體起反響。用洗刷的辦法使固相載體上構(gòu)成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的別的物質(zhì)分隔。再參加酶符號的抗原或抗體，也經(jīng)過反響而在固相載體上。此刻固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈必定的份額。參加酶反響的底物后，底物被酶催化變成有色產(chǎn)品，產(chǎn)品的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接有關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。因?yàn)槊傅拇呋β屎芨撸苯拥財(cái)U(kuò)大了免疫反響的成果，使測定辦法到達(dá)很高的敏感度。
二、ELISA的類型
ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定辦法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶符號的抗原或抗體，稱為"物"（conjugate）；（3）酶反響的底物。根據(jù)試劑的來歷和標(biāo)本的狀況以及檢查的具體條件，可規(guī)劃出各種不一樣類型的檢查辦法。用于臨床查驗(yàn)的ELISA首要有以下幾種類型：
1.雙抗體夾心法測抗原
雙抗體夾心法是檢查抗原zui常用的辦法，操作進(jìn)程如下：
1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)合，構(gòu)成固相抗體。洗刷除掉未的抗體及雜質(zhì)。
2）加受檢標(biāo)本，保溫反響。標(biāo)本中的抗原與固相抗體，構(gòu)成固相抗原抗體復(fù)合物。洗刷除掉別的未物質(zhì)。
3）加酶標(biāo)抗體，保溫反響。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體。*洗刷未的酶標(biāo)抗體。此刻固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量有關(guān)。
4）加底物顯色。固相上的酶催化底物變成有色產(chǎn)品。經(jīng)過比色，測知標(biāo)本中抗原的量。
2.雙抗原夾心法測抗體
反響形式與雙抗體夾心法相似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶物，以檢查相應(yīng)的抗體。與直接法測抗體的不一樣之處為以酶標(biāo)抗原替代酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因而其敏感度相對高于直接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢查常選用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原構(gòu)造的不一樣，尋覓合適的符號辦法。
3.直接法測抗體
直接法是檢查抗體常用的辦法。其原理為使用酶符號的抗抗體（抗*抗體）以檢查與固相抗原的受檢抗體，故稱為直接法，操作進(jìn)程如下：
1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)合，構(gòu)成固相抗原。洗刷除掉未的抗原及雜質(zhì)。
2）加稀釋的受檢血清，保溫反響。血清中的特異抗體與固相抗原，構(gòu)成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗刷后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的別的成份在洗刷進(jìn)程中被洗去。
3）加酶標(biāo)抗抗體。可用酶標(biāo)抗人Ig以檢查總抗體，但通常多用酶標(biāo)抗人IgG檢查IgG抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體，然后直接地符號上酶。洗刷后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正有關(guān)。
4）加底物顯色本法首要用于對病原體抗體的檢查而進(jìn)行流行癥的確診。
直接法的長處是只需改換包被抗原就可使用同一酶標(biāo)抗抗體樹立檢查相應(yīng)抗體的辦法。直接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。盡管有時(shí)用粗提抗原包被也能獲得實(shí)踐有用的成果，但應(yīng)盡可能予以純化，以進(jìn)步實(shí)驗(yàn)的特異性。特別應(yīng)注意除掉能與通常健康人血清發(fā)作反響的雜質(zhì)，例如以 E.Coli為工程酶的重組抗原，如其間富含E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)作反響。抗原中也不能富含與酶標(biāo)抗人Ig反響的物質(zhì)，例如來自人血漿或人體安排的抗原，如不將其間的Ig去掉，實(shí)驗(yàn)中也發(fā)作假陽性反響。別的如抗原中富含無關(guān)蛋白，也會因竟?fàn)幬蕉绊懓蛔饔谩Ｖ苯臃ㄖ辛硪环N攪擾要素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。患者血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng)，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的外表。因而在直接法中，抗原包被后通常用無關(guān)蛋白質(zhì)（例如牛血清蛋白）再包被一次，以關(guān)閉（blocking）固相上的空閑空隙。別的，在檢查進(jìn)程中標(biāo)本須先行稀釋（1:40~1:200），以防止過高的陰性本底影響成果的判別。
4.競賽法測抗體
當(dāng)抗原材猜中的攪擾物質(zhì)不易除掉，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢查特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和必定量的酶標(biāo)抗體競賽與固相抗原。標(biāo)本中抗體量越多，在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因而陽性反響呈色淺于陰性反響。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有攪擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可選用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后參加抗原，構(gòu)成固相抗原。洗刷除掉抗原中的雜質(zhì)，然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競賽反響。競賽法測抗體有多種形式，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競賽，抗HBc ELISA通常選用此法。另一種形式為將標(biāo)本與抗原一起參加到固相抗體中進(jìn)行競賽，洗刷后再參加酶標(biāo)抗體，與在固相上的抗原反響。抗HBe的檢查通常選用此法。
5.競賽法測抗原
小分子抗原或半抗原因缺少可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因而不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，能夠選用競賽法形式。其原理是標(biāo)本中的抗原和必定量的酶標(biāo)抗原競賽與固相抗體。標(biāo)本中抗原量含量愈多，在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，zui終的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。
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