豚鼠晚期糖基化終末產物酶聯免疫詳細步驟

使用目的：
本試劑盒用于測定大鼠血清，血漿及相關液體樣本中的含量。
豚鼠晚期糖基化終末產物酶聯免疫詳細步驟實驗原理：
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中水平。用純化的抗體包被微孔板，往微孔中依次加入，再與 HRP 標記的 IGF-Ⅰ抗體結合，形成免疫復合物，經過*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中抗原濃度。
豚鼠晚期糖基化終末產物酶聯免疫詳細步驟試劑盒組成：
試劑盒組成    48 孔配置    96 孔配置    保存     
說明書    1 份    1 份              
封板膜    2 片（48）    2 片（96）  
密封袋    1 個    1 個    
酶標包被板    1×48    1×96    2-8℃保存
標準品：27µg/L    0.5ml×1 瓶    0.5ml×1 瓶    2-8℃保存
標準品稀釋液    1.5ml×1 瓶    1.5ml×1 瓶    2-8℃保存
酶標試劑    3 ml×1 瓶    6 ml×1 瓶    2-8℃保存
樣品稀釋液    3 ml×1 瓶    6 ml×1 瓶    2-8℃保存
顯色劑 A 液    3 ml×1 瓶    6 ml×1 瓶    2-8℃保存
顯色劑 B 液    3 ml×1 瓶    6 ml×1 瓶    2-8℃保存
終止液    3ml×1 瓶    6ml×1 瓶    2-8℃保存
濃縮洗滌液    （20ml×20 倍）×1 瓶    （20ml×30 倍）×1 瓶    2-8℃保存
樣本處理及要求： 
1.血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。
2.血漿：應根據標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。
3.尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4.細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到 100 萬/ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心 20 分1鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5.組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6.標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7.不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
1.標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔 10 孔，在*、第二孔中分別加標準品 100µl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液 50µl，混勻；然后從*孔、第二孔中各取 100µl 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液 50µl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50µl 棄掉，再各取 50µl 分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液 50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取 50µl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液 50µl，混勻后從第七、第八孔中分別取 50µl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液 50µl，混勻后從第九第十孔中各取 50µl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50µl，濃度分別為 18µg/L，12µg/L ，6µg/L，3µg/L，1.5µg/L）。
2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40µl，然后再加待測樣品 10µl（樣品zui終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3.溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
4.配液：將 30（48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30（48T 的 20 倍）倍稀釋后備用。
5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復 5 次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶標試劑 50µl，空白孔除外。
7.溫育：操作同 3。
8.洗滌：操作同 5。
9.顯色：每孔先加入顯色劑 A50µl，再加入顯色劑 B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 分鐘.
10.終止：每孔加終止液 50µl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11.測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止液后 15 分鐘以內進行。
豚鼠晚期糖基化終末產物酶聯免疫詳細步驟注意事項：
1． 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2． 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3． 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在 5 分鐘內，如標本數量多，*使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本 OD 值大于標準品孔*孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n 倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6． 底物請避光保存。
7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9． 本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
計算：以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的 OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。（此圖僅供參考）
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數 R 值為 0.95 以上。
2.批內與批見應分別小于 9%和 11%檢測范圍：1µg/L -20µg/L
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6 個月