ELISA試劑盒的實驗詳細來實踐

  ELISA試劑盒時就面對許多艱難，雖然有師兄師姐鋪路，但仍是常常做得烏煙瘴氣，比如說花板，假陽性，全顯色，悉數顯色，顯色比空白還低,自個也為此煩惱過很長一段時間，跟著自個技術水平得進步，或多或少地也把握了ELISA試劑盒體系的脾氣，也是游刃有余吧，如今做方陣，做ELISA試劑盒已是駕輕就熟了，曾經檢查一種抗體用整整一下午還算得暈暈的，如今給我十個八個的從包被到顯色，一個作業日根本搞定。下面就由我拋磚引玉地來說一下，做ELISA的經驗總結:

 1、包被原的性質很首要，蛋白濃度，是不是降解，這到你做出的抗體可不可以被其辨認，所以保留抗原很首要，我做重組蛋白時，師兄都嚴厲正告我必定要在冰浴下緩慢消融即是這個道理。還有有的包被原也許不是蛋白，對于*和脂類物質或小分子物質咱們要事前對其改造再加以包被，我把辦法扼要的列出如下:①親和素*:先親和素先包被載體，參加*化的DNA，這種包被辦法均勻、結實，已擴展應用于各種抗原物質的定量測定。②脂類物質:可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解后參加ELISA試劑盒板孔中，開蓋置冰箱guo ye或涼風吹干，待酒精蒸發后，讓脂質天然干固在固相外表。③小分子有必要依托和大的蛋白載體偶聯后才干固定在固相載體上。

 2、ELISA試劑盒包被液的挑選，通常挑選ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時由于實驗的需要，包被原的特殊性也也許選用中性的緩沖溶液來包。應留意以下原理：由于蛋白質與聚苯乙烯固相載體是經過物理吸附的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體外表的疏水基團間的效果，這種物理吸附對錯特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響，大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體外表。詳細的實驗還要有鞏固的理論外也要實踐，看一下終究可不可以應用到自個實驗當中去。常用的包被液除了方才說到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。

 3、關閉：繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的進程。關閉即是讓很多不相關的蛋白質充填這些空地，然后排擠ELISA試劑盒后的過程中攪擾物質的再吸附。常用關閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，對比價廉，可以高濃度運用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動物血清(首要為了掃除相似蛋白攪擾)和酪蛋白等等。但終究選用啥要依據。

 4、洗刷板：可以說在ELISA試劑盒操作中，洗刷是zui首要的關鍵技術。由于聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，為到達別離游離的和的酶符號物的意圖，鏟除殘留在板孔中游離的物質，以及非特異性地吸附的攪擾物質，在洗刷時又應把這種非特異性吸附的攪擾物質洗刷下來。所以在洗板時會有必定差錯，人為因素很大(當然有條件的用洗板機在外)，洗的不*或串了孔，對如此活絡的ELISA試劑盒體系可是不小的影響。

 5、ELISA試劑盒加抗體標本(和二抗):留意該換槍頭時換槍頭。標本稀釋通常可用pbs稀釋，也可用關閉液去稀釋。如需加二抗，還要留意二抗的作業濃度，太高浪費，太低則上色淺。