錢(qián)美圓，徐波
應(yīng)用技術(shù)研究中心
近日，三泰科技制備純化實(shí)驗(yàn)室的純化工程師小錢(qián)接到某制藥公司委托的樣品制備純化任務(wù)，需要對(duì)某極性很大且難溶于水的樣品進(jìn)行制備純化。基于樣品的性質(zhì)，小錢(qián)首先想到了正相分離模式，但是經(jīng)過(guò)小量樣品的純化預(yù)實(shí)驗(yàn)后，小錢(qián)發(fā)現(xiàn)樣品在正相分離柱上保留太強(qiáng)以至于很難洗脫下來(lái)，看來(lái)正相模式是行不通了。
沒(méi)關(guān)系，還可以嘗試反相分離模式，于是小錢(qián)稱(chēng)取了50 mg樣品，溶于5 mL乙腈/甲醇/水/DMF（V:V:V:V=23:23:2:2）中，超聲加熱使樣品*溶解，然后根據(jù)樣品的HPLC分析條件設(shè)置好洗脫梯度，并根據(jù)實(shí)際制備分離過(guò)程中的出峰情況實(shí)時(shí)調(diào)整梯度設(shè)置，制備純化的實(shí)驗(yàn)條件如表1所示。
表1. 小量樣品制備純化實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置
圖1. 小量樣品的制備分離圖譜
制備分離圖譜如圖1所示，從預(yù)實(shí)驗(yàn)的分離結(jié)果來(lái)看，目標(biāo)產(chǎn)物可以與雜質(zhì)有效的分離，且分離度較高，可以滿足目標(biāo)物和雜質(zhì)分別收集的需求。于是，小錢(qián)接下來(lái)進(jìn)行了放大實(shí)驗(yàn)，她將1 g樣品溶于50 mL甲醇/乙腈/水/DMF（V:V:V:V=23:23:2:2）中，超聲加熱使樣品*溶解，然后設(shè)置好制備純化實(shí)驗(yàn)的參數(shù)，如表2所示。
表2. 樣品量放大后的制備純化實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置
圖2. 樣品量放大后的制備分離圖譜
制備分離圖譜如圖2所示，分析圖譜可知，在上樣量放大20倍后，所用分離柱放大了相應(yīng)的比例，但由于樣品的溶劑問(wèn)題使分離結(jié)果與預(yù)期不符。因DMF在紫外檢測(cè)波段有強(qiáng)吸收，會(huì)干擾樣品的檢測(cè)，因此在配置樣品溶液時(shí)使用了高比例的甲醇和乙腈。在此條件下大體積上樣時(shí)形成了體積過(guò)載，因此大量樣品隨著洗脫溶劑很快就被洗脫出來(lái)，未能獲得有效的保留和分離。此外，由于330 g純化柱有效柱床高度相比25 g純化柱沒(méi)有成比例的增加，因此前者的柱效相比后者下降較多，這也導(dǎo)致了分離圖譜中目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)未能有效分離。小錢(qián)在與同事們討論后，決定只好放棄一步到位的想法，利用DMF溶劑溶解少量樣品后，分多次對(duì)樣品進(jìn)行制備純化。
小錢(qián)稱(chēng)取了600 mg樣品，溶于6 mL DMF中，超聲加熱使樣品*溶解后，開(kāi)始進(jìn)行樣品分離純化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置如表3所示。
表3. 改進(jìn)后的放大制備純化實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置
圖3. 改進(jìn)后的樣品制備分離圖譜
小錢(qián)利用相同的實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置，對(duì)總計(jì)6.5 g樣品進(jìn)行了多次進(jìn)樣，圖3所示為其中兩次的樣品制備分離圖譜。分析圖譜可知，在減小樣品進(jìn)樣體積后，樣品得到了有效的分離純化，目標(biāo)產(chǎn)物和雜質(zhì)分離度良好，且分離重現(xiàn)性不錯(cuò)。經(jīng)HPLC分析，純化后收集的目標(biāo)產(chǎn)物純度為98.4%，回收率89.4%，雜質(zhì)純度為88.1%，回收率74.8%，樣品分離前后的HPLC分析圖譜如圖4所示。
圖4. 分離前樣品、分離純化后得到的目標(biāo)產(chǎn)物及雜質(zhì)的HPLC分析圖譜
總結(jié)這個(gè)樣品制備純化案例，在對(duì)此類(lèi)具有很大極性同時(shí)又難溶于水的樣品進(jìn)行分離純化時(shí)，可以參考本案例中的思路，即采用少量有機(jī)相溶劑對(duì)樣品進(jìn)行溶劑后，分多次進(jìn)樣，進(jìn)而完成全部樣品的制備純化。三泰科技出品的SepaBeanTM machine配合SepaFlash系列反相純化柱，可以為用戶提供快速的樣品制備純化解決方案，助力實(shí)驗(yàn)室研究人員輕松完成各類(lèi)樣品純化任務(wù)。
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