幾種三聚氰胺快速檢測方法比較
2007年3月,美國發(fā)生多起因食用寵物食品而導(dǎo)致寵物中毒死亡事件。2008年9月,中國發(fā)生因食用三鹿嬰幼兒奶粉導(dǎo)致嬰幼兒產(chǎn)生腎結(jié)石病癥的嚴(yán)重事件。兩起事件的原因都是在食品或飼料中非法添加大劑量三聚氰胺。因此,如何快速準(zhǔn)確的分析食品和飼料中的三聚氰胺成為食品企業(yè)、食品管理機(jī)構(gòu)和廣大消費(fèi)者密切關(guān)注的問題。
為科學(xué)合理地篩選快速、簡便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的三聚氰胺檢測方法，中國*提出搭建快速檢測方法測試平臺(tái)的建議，并承擔(dān)了*應(yīng)急支撐項(xiàng)目“三聚氰胺快速檢測技術(shù)測試平臺(tái)的建設(shè)"。
該平臺(tái)啟動(dòng)以來，以檢測技術(shù)為支撐，以盲樣測試結(jié)果為依據(jù)，開展技術(shù)評(píng)價(jià)，在國內(nèi)*“統(tǒng)一現(xiàn)場測試、統(tǒng)一評(píng)價(jià)方案、統(tǒng)一判別依據(jù)、統(tǒng)一專家評(píng)審、統(tǒng)一現(xiàn)場公布測試結(jié)果"的三聚氰胺檢測方法評(píng)價(jià)模式。以比對互認(rèn)為基礎(chǔ)，建立乳與乳制品中的三聚氰胺氣相色譜同位素稀釋質(zhì)譜法和液相色譜同位素稀釋質(zhì)譜法，為評(píng)價(jià)快速檢測方法奠定了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。
為確保三聚氰胺檢測結(jié)果的有效性，全面提高檢測實(shí)驗(yàn)室對原料乳及奶粉中三聚氰胺檢測能力水平，測試平臺(tái)先后組織實(shí)施了5輪全國三聚氰胺快速檢測技術(shù)方法的現(xiàn)場統(tǒng)一測試評(píng)價(jià)活動(dòng)，共測試評(píng)價(jià)了56種檢測技術(shù)或方法，有效推出液相色譜法、拉曼光譜法、膠體金試免疫層析法（膠體金速測卡法）、酶聯(lián)免疫法(ELISA試劑盒法)4種三聚氰胺快速檢測方法。
本文對常用的三種三聚氰胺快速檢測方法：液相色譜法、酶聯(lián)免疫法和膠體金免疫層析法的原理、特點(diǎn)做簡單介紹并對其應(yīng)用進(jìn)行比較。
1.液相色譜法
國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T22400??2008公布了原料乳中三聚氰胺快速檢測的液相色譜法（HPLC法）,采用乙腈作為原料乳中的蛋白質(zhì)沉淀劑和三聚氰胺提取劑,0.2um微孔濾膜過濾后供HPLC測定。采用的色譜柱為強(qiáng)陽離子交換色譜柱,流動(dòng)相為乙腈??緩沖液(10mmol/L檸檬酸,10mmol/L辛烷磺酸鈉,調(diào)節(jié)pH至3.0),采用紫外/二極管陣列檢測器檢測,定量限為0.3mg/kg,定量靈敏度提高,且分析時(shí)間較短。HPLC法雖然應(yīng)用普遍,但存在一定的局限性,樣品前處理過程復(fù)雜,儀器昂貴,對檢測人員的要求高，檢測成本高。
1.1原理
用乙腈作為原料乳中的蛋白質(zhì)沉淀劑和三聚氰胺提取劑，強(qiáng)陽離子交換色譜柱分離，液相色譜-紫外檢測器/二極管陣列檢測器檢測，外標(biāo)法定量。
1.2主要試劑和材料
1.2.1乙腈（CH3CN）：色譜純。
1.2.2磷酸（H3PO4）。
1.2.3磷酸二氫鉀（KH2PO4）。
1.2.4三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（C3H6N6）：純度大于或等于99%。
1.2.5三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：1.00×103mg/L。
1.3.儀器
1.3.1液相色譜儀：配有紫外檢測器/二極管陣列檢測器。
1.3.2分析天平：感量0.0001g和0.01g。
1.3.3pH計(jì)：測量精度±0.02
1.4檢驗(yàn)操作：按國標(biāo)GB/T22400??2008要求操作。
2.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)
酶聯(lián)免疫法(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)是在免疫熒光和組織化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)。其主要是利用抗原與抗體的高特異性反應(yīng)，通過合適的載體，使酶標(biāo)抗原或抗體與待測樣品反應(yīng)，形成酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物，在相應(yīng)的酶底物參與下，復(fù)合物上的酶催化底物使之水解成有色物質(zhì)。一定條件下，呈色物質(zhì)與待測物的含量直接相關(guān)，因此可以根據(jù)呈色物質(zhì)顏色的深淺，對待測樣品進(jìn)行定性定量分析。
近幾十年,國內(nèi)外已建立了數(shù)十種藥物殘留的ELISA分析技術(shù),檢測水平可達(dá)ng甚至pg水平。一些發(fā)達(dá)國家已經(jīng)研制成商品化的檢測試劑盒用于快速檢測。近十多年來我國也研發(fā)出多種商品化的檢測試劑盒用于快速檢測。
酶聯(lián)免疫吸附法具有特異性高、靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡單、成本低，并可同時(shí)對大批量樣品進(jìn)行快速檢測的特點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于食品中獸藥、毒素檢測的初篩中。
08年中國出現(xiàn)“三聚氰胺奶粉事件"時(shí)，主要使用的進(jìn)口三聚氰胺速測試劑盒，現(xiàn)在國內(nèi)也已研發(fā)出商品化的三聚氰胺速測試劑盒，試劑盒靈敏度0.01ppm,zui低檢測限為0.1ppm,已廣泛用于快速檢測。
2.1原理
采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被三聚氰胺抗原，樣本殘留的三聚氰胺和微孔條上預(yù)包被的抗原競爭抗三聚氰胺抗體，加入TMB底物顯色，樣本吸光值與其殘留物三聚氰胺成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣本中三聚氰胺的含量。
2.2主要試劑、材料
三聚氰胺ELISA檢測試劑盒
2.3儀器
2.3.1獸藥殘留分析儀或酶標(biāo)儀
2.3.2分析天平：感量0.01g
2.4檢驗(yàn)操作：按三聚氰胺ELISA檢測試劑盒說明書要求操作。
3.膠體金免疫層析技術(shù)
膠體金免疫層析技術(shù)（ColloidalGoldImmunochromatographicAssay，GICA)是以膠體金為標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)，免疫層析(Immunochromatography,IC)技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種將免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)相結(jié)合的快速免疫分析方法。其原理是以條狀纖維層析材料為固相,借助毛細(xì)作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng),同時(shí),使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗體或抗原)發(fā)生高特異、高親和性的免疫反應(yīng),層析過程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域(檢測帶),通過酶促顯色反應(yīng)或直接使用可目測的著色標(biāo)記物(如膠體金),短時(shí)間(5～10min內(nèi))便可得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
膠體金免疫層析技術(shù)不需進(jìn)行結(jié)合標(biāo)記物與游離標(biāo)記物的分離,省去了繁瑣的加樣、洗滌步驟。因而這種分析技術(shù)操作簡單快速,分析結(jié)果清楚,易于判斷,且無須儀器。
膠體金免疫層析技術(shù)在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用較多,在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用在近幾年才發(fā)展起來。國外在此方面起步較早,現(xiàn)在已經(jīng)有很多成熟的產(chǎn)品問世,國內(nèi)這幾年也發(fā)展較快，有多種應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)的商業(yè)化產(chǎn)品面世，三聚氰胺膠體金速測卡就是其中之一。
三聚氰胺膠體金速測卡檢測靈敏度高，結(jié)果直觀，操作方便、快捷，攜帶、儲(chǔ)存方便，成本低，非常適合于基層*部門對三聚氰胺的快速篩查。
3.1原理
三聚氰胺膠體金速測卡的檢測原理是競爭性免疫層析。將著色標(biāo)記物與待測抗原的特異性抗體(Ab1)相偶聯(lián),沉積在結(jié)合區(qū)。而檢測區(qū)處固相化的是待測抗原或待測抗原的類似物。若樣品中含有待測抗原,則樣品中的抗原和帶有標(biāo)記物的Ab1形成Ag-Ab1復(fù)合物。隨后在通過固相化有待測抗原或其類似物的檢測區(qū)時(shí),由于競爭抑制,不再發(fā)生反應(yīng),檢測線處不顯色;樣品繼續(xù)前移,Ag-Ab1復(fù)合物被固相化在質(zhì)控線處的抗Ab1抗體(Ab2)所結(jié)合,形成Ab1-Ag-Ab2復(fù)合物,使質(zhì)控線顯色。
3.2主要試劑、材料
三聚氰胺膠體金速測卡
3.3檢驗(yàn)操作：按三聚氰胺膠體金速測卡說明書要求操作。
4.三種三聚氰胺快速檢測方法的比較
方法 | 液相色譜法 | 酶聯(lián)免疫吸附法 | 膠體金免疫層析法 |
儀器 | 液相色譜儀 | 獸藥殘留分析儀/酶標(biāo)儀 |
|
試劑（盒） | 色譜純試劑 | ELISA檢測試劑盒 | 膠體金速測卡 |
| 定性、定量 | 定性、定量 | 定性、半定量 |
檢測靈敏度 | 0.05ppm | 0.1ppm | 0.1ppm |
樣品前處理 | 復(fù)雜 | 較復(fù)雜 | 簡單 |
檢測操作方法 | 復(fù)雜 | 較復(fù)雜 | 簡單 |
單個(gè)樣品檢測時(shí)間 | 30-50分鐘 | 1-1.5小時(shí) | 3-5分鐘 |
批量檢測時(shí)單個(gè)樣品平均時(shí)間
| 15-25分鐘 | 10-20分鐘 | 1-3分鐘 |
儀器市場價(jià) | 大于40萬元 | 4-7萬元 |
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耗材市場價(jià) | 50-200元/個(gè) | 2500元/96孔 | 20元/條 |
適合場所 | 實(shí)驗(yàn)室 | 實(shí)驗(yàn)室、檢測車 | 基層*單位、企業(yè) |
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