生物實驗中細胞融合前準備

一、骨髓瘤細胞系的選擇

    骨髓瘤細胞應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。用于融合試驗的主要骨髓瘤細胞系有P3/X63-Ag8（X63）、P3/X63-Ag8.653（X63-Ag8.653）、P3/NSI-1-Ag4-1（NS-1）、P3/X63-Ag8.Ul（P3Ul）、SP2/0-Ag14（SP2/0）、F0、S194/5.XXO.BU.1、MPC11-45.6TG1.7、210.RCY3.Ag1.2.3、GM15006TG-A12及U-266AR等。

    骨髓瘤細胞可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細胞濃度以104～5×105/ml為宜，zui大濃度不得超過106/ml。當細胞處于對數(shù)生長的中期時，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細胞在傳代過程中，部分細胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8-氮*進行處理，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。

　  在組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細胞不易生長繁殖，若加入其它活細胞，則可促進這些細胞生長繁殖，所加入的這種細胞被稱為飼養(yǎng)細胞。在制備McAb的過程中，許多環(huán)節(jié)均需要加飼養(yǎng)細胞，如在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細胞。飼養(yǎng)細胞的量一般為2×104或105細胞/孔。

二、細胞融合的步驟

    細胞融合一般包括制備飼養(yǎng)細胞層、制備免疫脾細胞、制備骨髓瘤細胞及融合等四個步驟。

    制備飼養(yǎng)細胞層時一般選用小鼠腹腔巨噬細胞，與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周后拉頸處死；浸泡在75%酒精內(nèi)，3～5min后用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜，用*注入5～6ml預冷的培養(yǎng)液（嚴禁刺破腸管），反復沖洗，吸出沖洗液放入10ml離心管，1200rpm分離5～6min后，用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細胞數(shù)至1×105/ml，進行培養(yǎng)。

　　制備免疫脾細胞時先將zui后一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死，無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗 一次后，將脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)后離心，細胞用培養(yǎng)液洗2次，計數(shù)后取108脾淋巴細胞懸液備用。

　　制備骨髓瘤細胞時應(yīng)取對數(shù)生長骨髓瘤細胞離心，用無血清培養(yǎng)液洗2次，計數(shù)后取1×107細胞備用

　　融合時先將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不*培養(yǎng)液洗1次，離心后棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。在90s內(nèi)加入37℃預溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml的不*培養(yǎng)液以終止PEG作用。離心棄上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。將上述細胞，加到已有飼養(yǎng)細胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。