免疫熒光技術(shù)之染色方法

一、制片

    選無自發(fā)性熒光的石英玻片或普通玻片，洗凈后浸泡于無水乙醇等量混合液中。用時取出用綢布擦凈。將待檢樣品如組織塊剪成適當大小印壓于玻片上。也可采用冰凍切片或石蠟切片樣品。
二、固定

    除研究細胞表面抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定外，一般均應(yīng)固定。
    固定的作用有三：
    1.  防止標本從玻片上脫落。
    2.  除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果。
    3.  固定的標本易于保存，如組織切片固定后在-20℃下可保存一年而不改變其染色特性。

    標本的固定原則是：
    1.  不能損傷細胞內(nèi)的抗原。
    2.  不能凝集蛋白質(zhì)。
    3.  不能損傷細胞形態(tài)。
    4.  固定后應(yīng)保持細胞膜的通透性，以允許抗體進入與抗原結(jié)合。
三、水洗

    固定后以冷的0.01 Mol/L pH7.4PBS液浸泡沖洗，zui后以蒸餾水沖洗，防止自發(fā)性熒光。
四、染色

    染色分直接染色法與間接染色法。

    1.  材料與試劑

    （1）熒光抗體，稀釋至應(yīng)用濃度。

    （2）0.01 Mol/L pH7.4PBS液

    （3）9份甘油加1份pH7.4PBS液即為甘油緩沖液。甘油有減少非特異性熒光的作用。

    （4）帶蓋方盤

    2.  直接染色法

    （1）將固定好的玻片置于濕盤中，滴加熒光抗體染色液，以覆蓋為度，加蓋，37℃感做30 min~45min。

    （2）PBS沖洗3次，每次沖洗3 min，即3×3沖洗。

    （3）蒸餾水沖洗。

    （4）滴甘油緩沖液一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

    3.  間接染色法

    （1） 檢查抗原：
    ①取固定標本，加已知的免疫血清，37℃孵育30 min。
    ②以PBS液3×3沖洗。
    ③再加熒光標記的抗抗體，37℃孵育30 min。
    ④PBS 3×3沖洗。
    ⑤H2O沖洗，涼干。
    ⑥加甘油緩沖液，封片、鏡檢。

    （2）檢查抗體：
    ①免疫后動物的淋巴組織涂片，自然干燥，甲醇固定。
    ②滴加相應(yīng)抗原液（按1：100~1：500稀釋），37℃孵育30 min。
    ③PBS液3×3沖洗。
    ④加熒光抗體，37℃孵育30 min。
    ⑤PBS液3×3沖洗。
    ⑥水洗，涼干。
    ⑦加甘油緩沖液，封片、鏡檢。