內(nèi)切酶的特性、酶解與瓊脂糖凝膠電泳

     限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。是體外剪切基因片段的重要工具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。

     瓊脂糖凝膠電泳：是利用瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔隙的固體基質(zhì)的特性，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場的作用下及中性pH的緩沖條件下帶負電的核酸分子就可以向陽極遷移。瓊脂糖凝的濃度影響給定大小的線狀DNA的遷移率，因此采用不同濃度的凝膠可以分離不同大小范圍的DNA*段。

     EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽,(Ethidium Bromide)。它能夠插入DNA分子中的堿基對之間而與DNA結(jié)合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的DNA條帶呈現(xiàn)出紅色熒光，易于檢測。可以檢測10ng 的DNA。

     質(zhì)粒pCMV-Myc-T10 NEB 標準分子量片段(1kb DNA Ladder)EcoR1 和Xho1 核酸內(nèi)切酶（Takara）EcoR 1和Xho 1酶解緩沖液(10×H buffer)瓊脂糖TBE或TAE緩沖液(10×)溴化乙啶染色液(10mg/ml)上樣液(6×)：0.25% 溴酚蘭，40%(W/V)蔗糖水溶液或30%的甘油。電泳儀，電泳槽，紫外透射儀，凝膠成像儀，一次性塑料手套等.

     瓊脂糖凝膠的制備:稱取0.8g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入100ml TBE或TAE工作液，瓶口倒扣一個小燒杯等，將該三角瓶置于微波爐加直至瓊脂溶解。

     膠板的制備:取有機玻璃內(nèi)槽，洗凈、晾干；取紙膠條(寬約1cm)，將有機玻璃內(nèi)槽置于一水平位置模具上，放好梳子。將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠液，小心地倒在有機玻璃內(nèi)槽上，控制灌膠速度和量，使膠液緩慢地展開，直到在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置30min左右，待凝固*后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機玻璃內(nèi)槽放在含有0.5-1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的電泳槽中使用。

     加樣:用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品孔內(nèi)。每加完一個樣品，換一個加樣頭。加樣時應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部，本實驗樣品孔容量約15～20μl。1 kb DNA ladder（共10條帶）: 在*個上樣孔或zui后一個上樣孔內(nèi)加入6μl 的1 kb DNA ladder（50ng/μl ）。

     電泳（帶上手套操作）:

     1.加完樣后的凝膠板即可通電進行電泳； 

     2.建議在80～100V的電壓下電泳；

     3.當溴酚蘭移動到距離膠板下沿約1cm處停止電泳；

     4.將凝膠放入溴化乙啶（EB〕工作液（0.5μg/ml左右）中染色約20min。

     為了獲得電泳分離DNA*段的zui大分辨率，電場強度不應(yīng)高于5V/cm（兩電極間的距離）。電泳溫度視需要而定，對大分子的分離，以低溫較好，也可在室溫下進行。在瓊脂糖凝膠濃度低于0.5%時，由于膠太稀，在4℃進行電泳以增加凝膠硬度。

     觀察與拍照:在紫外燈(310nm波長)下觀察染色后的凝膠。DNA存在處顯示出紅色的熒光條帶。紫外光激發(fā)30s左右，肉眼可觀察到清晰的條帶。在紫外燈下觀察時，應(yīng)戴上防護眼鏡或有機玻璃防護面罩，避免眼睛遭受強紫外光損傷。拍照電泳圖譜時，可采用快速凝膠成象系統(tǒng)。

     對于未進行酶切的質(zhì)粒來說，常會出現(xiàn)兩條電泳帶，一條是（松弛）螺旋狀質(zhì)粒DNA帶，另一條是超螺旋狀質(zhì)粒DNA的帶，以超螺旋狀質(zhì)粒DNA居多，移動速度也zui快。有時還會出現(xiàn)三條帶，其中一條是因為有一些質(zhì)粒DNA在提取過程中遭到損傷而線性化，其移動速度介于螺旋狀和超螺旋狀質(zhì)粒DNA之間，所以該條電泳帶也位于上述兩種帶之間。如果提取的質(zhì)粒很好時，這條帶會很弱，有時看不到。

     本實驗所用質(zhì)粒pCMV-Myc-T10經(jīng)EcoR1單酶切后應(yīng)為5.7kb；用EcoR1和Xho1雙酶切后應(yīng)產(chǎn)生兩條DNA*段，一條是3.8kb，另一條是1.9kb