人VL基因文庫的構建

[方法]
1．配制4個獨立的50ul PCR反應混合液， 包含：
● 水，35．5ul
● 20XdNTP（每種5mmol／L），2．5ul
● 10XVent聚合酶緩沖液，5．0ul
● FdSEQl引物 （10pmol/u1），2．5ul
● 反向引物（10pmol/u1），2．5ul
● 單鏈scFv模板DNA（10ng），1．0ul
● Vent DNA聚合酶（2單位），1．0ul
2．在有加熱蓋的熱循環儀內加熱反應混合液到94℃5分鐘。
3.以94℃30秒、42℃30秒、72℃1分鐘的條件共循環25次，擴增VL基因。
4．用Wizard PCR純化試劑盒純化PCR產物。
5．用XhoI和NotI消化PCR產物；但除了用XhoI替代 NcoI，還需用NEB2緩沖液和BSA，按照廠家要求進行。
6．用XhoI和NotI消化pHENl—VL3載體DNA；但不要用XhoI替代NcoI。
7．連接已消化的PCR產物和已消化的載體，并電轉化到大腸桿菌TGl細胞中，構建4個VL基因噬菌體文庫。測定文庫容量并將細菌性文庫材料儲存于-70℃。
8．用含甘油文庫儲存材料細菌接種到含100ug／ml氨芐*和1％葡萄糖的100ml 2X TY培養基中，制備每種VL基因文庫DNA。接種量應足夠大以保證接種細菌數至少比文庫容量大5倍。過夜培養后，按標準的DNA質粒制備方法進行操作。為了續后進行文庫消化，可合并不同文庫的DNA。