用突變的VlCDR3構建SCFv基因文庫

[方法]
1．設計合成含有CDR3隨機化序列的VLFOR引物。當然，此引物必須以擬進行親和力成熟的抗體VL基因作為基礎進行設計。本例中，VLCDR3的7個氨基酸被隨機化。在每個隨機化位點中，保留了大約50％野生型氨基酸。引物設計結果如下：
VLFOR隨機引物： 5’—CCC TCC GCC GAA CAC CCA ACC 524 513 524 524 542 541 511 CTG GCA GTA ATA ATC AGC CTC—3’
數字對應摩爾分數如下。
（1）A（70％）、C（10％）、G（10％）、T（10％）。
（2）A（10％）、C（70％）、G（10％）、T（10％）。
（3）A（10％）、C（10％）、G（70％）、T（10％）。
（4）A（10％）、C（10％）、G（10％）、T（70％）。
（5）G（50％）、C（50％）。
利用分子建模去識別哪個CDR3殘基具有溶劑可接近側鏈，來確定隨機化殘基。
2．配制4個50w1 PCR反應混合液，包含：
● 去離子水，35．5ul
● 20XdNTP， 2．5ul
● 10XVent聚合酶緩沖液，5．0ul
● lMB3引物（10pmol/ul），2．5ul
● VI-FOR引物 （10pmol/ul）， 2．5ul
● 野生型scFv基因模板DNA（100ng）， 1．0ul
● VentDNA聚合酶（2單位），1．0ul
3．在有加熱蓋的熱循環儀內加熱混合液到94℃，5分鐘。
4．以94℃1分鐘、42℃1分鐘、72℃2分鐘的條件共循環30次，擴增VL基因。
5．在1％瓊脂糖膠上膠純化VL基因（接近800bp）；用Geneclean試劑盒提取DNA。將
每種產物重懸于20ul水中。在1％瓊脂糖凝膠上與已知大小和濃度的標準對照品比較，測定DNA濃度。