選擇和篩選親和力更高的抗體

        選擇方法必須精心設(shè)計以便能選擇到親合力更高的抗體．而非那些在隙菌體中展示較佳、對大腸桿菌毒性較低、較為穩(wěn)定或者多聚化形成而改變親和性（avidity）使得功能性親和力提高的克隆。有兩種方法可用于從低親和力或非結(jié)合性scFv本底下選擇到稀有的高親和力scFv：一種是根據(jù)結(jié)合動力學(xué)方法；另一種是根據(jù)平衡常數(shù)（Kd）的方法。無論哪種方法，很重要的是，要采用液相標(biāo)記抗原而不是吸附于固相基質(zhì)的抗原。使用可溶性抗原將偏向于根據(jù)結(jié)合親和力或結(jié)合動力學(xué)的選擇．而不是依據(jù)親和性（avidity）的選擇。當(dāng)對scFv文庫進行選擇時．這尤為重要。因為已知有些scFv能按照一種序列依賴方式自發(fā)形成二聚體。不采用可溶性抗原可能導(dǎo)致選擇到二聚化scFv，而其單價結(jié)合常數(shù)并不高于野生型。甚至對于Fab模式也要采用可溶性抗原，從而避免選擇到展示了多拷貝Fab的噬菌體，后者僅有更高的功能性親和力（avidity）而已。

在基于結(jié)合動力學(xué)，也被稱為解離速率（κoff）]的選擇中，在將遠遠過量的非標(biāo)記抗原加入到混合液中并維持一段特定時間之前，將首先選用飽和量的標(biāo)記抗原使其與噬菌體群結(jié)果。通過確定與末標(biāo)記抗原競爭的持續(xù)的時間，將允許大多數(shù)結(jié)合的野生型抗體解離，而優(yōu)化的突變體卻仍然結(jié)合著，這個方法對于具有較慢解離速率的突變體的選擇是很有效的。因為V基因無論在體內(nèi)或體外發(fā)生突變時，κoff下降都是一個產(chǎn)生高親和力的主要動力學(xué)機制。一般而言，此法可以選擇到（Kd）更佳的scFv。

我們通常傾向于平衡選擇法。在這個方法中，噬菌體與濃度低于平衡結(jié)合常數(shù)的抗原一同被孵育。它可以有效地選擇到改善平衡常數(shù)的抗體。抗原濃度下降也有助于確保選擇到高親和力scFv，而不是那些在噬菌體中表達較佳或?qū)Υ竽c桿菌毒性較低的抗體。使用可溶性抗原就能設(shè)置超過平衡選擇方法所需抗原濃度的對照。噬菌體可以先結(jié)合*化抗原，而后用鏈霉親和素化磁珠進行回收。可以預(yù)先估計選擇所用的適宜抗原濃度，但我們傾向于在*輪中采用幾個不同的抗原濃度。后續(xù)幾輪選擇的抗原濃度可以根據(jù)測定結(jié)合性噬菌體在產(chǎn)出的多克隆噬菌體中結(jié)合性噬菌體的比例來決定。用Biacore進行表面等離子共振技術(shù)（SPR）測定是為準(zhǔn)確的。結(jié)合濃度測定是在物質(zhì)運輸受限條件下進行的。另外．也可用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定結(jié)合性克隆的比例。分析這些數(shù)據(jù)就可以在下一輪選擇前確定出佳抗原濃度。我們在每一輪選擇后，一般會把抗原濃度降低10～100倍。在3～5輪選擇后，就可以篩選親和力得到優(yōu)化的克隆了。