V基因文庫的裝配和克隆

       為構建噬菌體抗體文庫，無論是scFv模式或是Fab模式，VH基因都需要與VL基因并列到同一質粒中。雖然以下討論特別涉及scFv構建，但其內容同樣適用于Fab的構建。在每種情況下，兩個V基因之間區(qū)域都起到將兩者連為一體的作用。對于scFv片段，這個區(qū)域編碼的是一段多肽接頭，以此共價連接兩個V基因。而對于Fab，此區(qū)域則是一段DNA，其中包括了1個核糖體結合位點和1個前導序列。
有3個連接VH和VL基因的基本方法：即PCR裝配法（有關方案在本章提供）、序貫克隆法以及重組法。早期抗體文庫的創(chuàng)建采用重疊延伸進行PCR拼接（裝配）。而后來的抗體文庫則是先構建單獨的VM和VL文庫，然后再用標準方法將任何一個文庫克隆到另外一個文庫中進行裝配，或者用已克隆的材料進行PCR裝配。
PCR裝配法涉及兩個或三個片段的剪接。在兩個片段裝配時，用互相重疊的引物擴增V基因，這樣就可以通過PCR形成接頭區(qū)域將二者剪接在一起。但這只在接頭為非重復性時，才是可行的，因此，不適合使用scFv文庫中常用的（Gly4Ser）3接頭。這也同樣不適用于Fab片段的裝配，因為接頭區(qū)過長就難以用兩個引物重疊進行構建。當構建由Gly—Ser接頭連接的scFv片段文庫時，要么重疊區(qū)域必須能延伸至相對的一條鏈，要么接頭必須先單獨構建成一個片段文庫，每種也都要與不同的VM和VL基因有同源性。這個接頭再以三片段裝配形式與VM和VL基因進行剪接。