體外DNA重組的技術要點

1 油的覆蓋及反應體系的體積
如果PCR儀不加熱反應小管的管蓋，你需要在反應混合物上覆蓋密度小的礦物油以防止蒸發。在反應小管的管蓋總是被加熱到高于96℃的PCR儀中，可以不加礦物油進行PCR反應。油覆蓋得不充分會導致蒸發，這將導致更高的反應濃度，并使得溫度降低。在大部分應用情況下，70ul油對于100ul反應體系、40ul油對于50ul反應體系及30ul油對于25ul反應體系是大致充足的。過多的油會影響熱傳遞。要注意始終使用合適的油量。

2 試劑質量的控制
DNA聚合酶本來就不穩定（如對起泡及高溫條件），總是需要在一20℃保存并在冰上使用。脫氧三磷酸腺苷也是熱不穩定的，其儲液必須分裝保存在一20℃，避免反復冰凍及解凍。氯化鎂在長期保存后可能形成沉淀，其儲液必須分裝保存在一20℃，避免反復冰凍及解凍。

3 瓊脂糖凝膠電泳
常常使用瓊脂糖凝膠電泳來對DNA片段進行分析并按大小區分開來。線性DNA分子的有效分離范圍是：在2％（w/v）瓊脂糖凝膠中為o．1—3kpb，在1．5％（w/v）瓊脂糖凝膠中為0．2—4kpb，在1．2％（w/v）瓊脂糖凝膠中為0．4—6kpb，以及在0．9％（w/v）瓊脂糖凝膠中為0．5～7kpb。為了分離在DNA改組中常用的短DNA片段（50～300bp），常用的濃度（0．8％一1．2％）可能不能很好地起作用。

常常很難在瓊脂糖凝膠中看到短DNA片段。在使用較長波長（如366nm）的紫外燈的預實驗中，這一點尤其成問題。另外，上樣緩沖液[10X上樣緩沖液：50％（體積分數）甘油、0．1％（w/v）溴酚藍、0．1％（w/v）二甲苯腈（xylene cyanol）]中的示蹤染色試劑也可能掩蓋DNA發出的熒光（在0．5％～1．4％的瓊脂糖凝膠中，溴酚藍的遷移率為約300bp，二甲苯腈的遷移率為約4000bp）。為達到理想的透明度，可以在甘油中稀釋上樣緩沖液直到它們微微可見為止。或者對樣品使用無染色試劑的上樣緩沖液，并在空的泳道中加入染色試劑以監控遷移。

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