雜交瘤技術(shù)的基本原理

 

    （一）細(xì)胞的選擇與融合

    建立雜交瘤技術(shù)的目的是制備對(duì)抗原特異的單克隆抗體，所以融合細(xì)胞一方必須選擇經(jīng)過(guò)抗原免疫的B細(xì)胞，通常來(lái)源于免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞。脾是B細(xì)胞聚集的重要場(chǎng)所，無(wú)論以何種免疫方式刺激，脾內(nèi)皆會(huì)出現(xiàn)明顯的抗體應(yīng)答反應(yīng)。融合細(xì)胞的另一方則是為了保持細(xì)胞融合后細(xì)胞的不斷增殖，只有腫瘤細(xì)胞才具備這種特性。·選擇同一體系的細(xì)胞可增加融合的成功率。多發(fā)性骨髓瘤是B細(xì)胞系惡性腫瘤，所以是理想的脾細(xì)胞融合伴侶。

    使用細(xì)胞融合劑造成細(xì)胞膜一定程度的損傷，使細(xì)胞易于相互粘連而融合在一起。佳的融合效果應(yīng)是低程度的細(xì)胞損傷而又產(chǎn)生高頻率的融合。聚乙二醇（PEG1 000～2 000）是目前常用的細(xì)胞融合劑，一般應(yīng)用濃度為40％（W／V）。

 

    （二）選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用

    細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的物理學(xué)過(guò)程。在小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞混合細(xì)胞懸液中，經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)。如融合的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞、融合的脾細(xì)胞和脾細(xì)胞、融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞、未融合的脾細(xì)胞、未融合的瘤細(xì)胞以及細(xì)胞的多聚體形式等。正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)基中僅存活5～7d，無(wú)需特別篩選；細(xì)胞的多聚體形式也容易死去；而未融合的瘤細(xì)胞則需進(jìn)行特別的篩選去除。

    細(xì)胞DNA合成一般有兩條途徑。主要途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，*作為重要的輔酶參與這一合成過(guò)程。另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)次黃嘌吟磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。細(xì)胞融合的選擇培養(yǎng)基中有3種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、*（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。*是*的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞利用正常途徑合成DNA，而融合所用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的HGPRT-細(xì)胞株，所以不能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。只有融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳性能，可在HAT培養(yǎng)基中長(zhǎng)期存活與繁殖。

 

    （三）有限稀釋與抗原特異性選擇

    在動(dòng)物免疫中，應(yīng)選用高純度抗原。一種抗原往往有多個(gè)決定簇，一個(gè)動(dòng)物體在受到抗原刺激后產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答實(shí)質(zhì)是眾多B細(xì)胞群的抗體分泌，而針對(duì)目標(biāo)抗原表位的B細(xì)胞只占極少部分。由于細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的過(guò)程，在已經(jīng)融合的細(xì)胞中有相當(dāng)比例的無(wú)關(guān)細(xì)胞的融合體，需經(jīng)篩選去除。篩選過(guò)程一般分為兩步進(jìn)行：一是融合細(xì)胞的抗體篩選，二是在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的特異性抗體篩選。將融合的細(xì)胞進(jìn)行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)在0至數(shù)個(gè)細(xì)胞之間（30％的孔為0才能保證每個(gè)孔中是單個(gè)細(xì)胞），培養(yǎng)后取上清液用ELISA法選出抗體高分泌性的細(xì)胞；這一過(guò)程常被習(xí)慣地稱作克隆化。將這些陽(yáng)性細(xì)胞再進(jìn)行克隆化，應(yīng)用特異性抗原包被的ELISA找出針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體陽(yáng)性細(xì)胞株，增殖后進(jìn)行凍存、體外培養(yǎng)或動(dòng)物腹腔接種培養(yǎng)。