考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量流程
該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較的，但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖核酸酶或*。去污劑的濃度超過(guò)0．2％影響測(cè)定結(jié)果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford濃染液的配制：將100rug考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50m1 95％乙醇，加入100ml濃磷酸，然后，用蒸餾水補(bǔ)充至200ml，此染液放413至少6個(gè)月保持穩(wěn)定。
2．標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)樣本的準(zhǔn)備：盡量使用與待測(cè)樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品，例如測(cè)定抗體，可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)。如果待測(cè)樣本是未知的，也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。通常在20ug—150ug／100ul之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3．將待測(cè)樣本溶于100~1緩沖溶液中，該緩沖溶液應(yīng)與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的緩沖溶液相同（用PBS）。
4．按1：5用蒸餾水稀釋濃染料結(jié)合溶液，如出現(xiàn)沉淀，過(guò)濾除去。
5．每個(gè)樣本加5ml稀釋的染料結(jié)合溶液，作用5～30rain。染液與蛋白質(zhì)結(jié)合后，將由紅色變?yōu)樗{(lán)色，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。注意，顯色反應(yīng)不得超過(guò)30min．
6．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本的濃度。
考馬斯亮藍(lán)和皮膚中蛋白質(zhì)通過(guò)范德華力結(jié)合，反應(yīng)快速，并且穩(wěn)定，無(wú)法用普通試劑洗掉。待一兩周左右，皮屑細(xì)胞自然衰老脫落即可無(wú)礙。
考馬斯亮藍(lán)R-250是電泳的
考馬斯亮藍(lán)G250和R250都可以染蛋白，一般用R250，G250染色后背景較深不易脫色。一般R250 染蛋白，G250 一般測(cè)蛋白濃度，也可染膠，敏感性更高但較慢脫色較難。
考馬斯亮藍(lán)G250常用的蛋白染料，作定性試驗(yàn)用,染色后為藍(lán)綠色;R250較敏感,做定量實(shí)驗(yàn)用,染膠效果較好.染色后為紅藍(lán)色。
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