真菌的DNA和RNA提取方法

一、真菌DNA的提取（方法一）

1.實驗試劑

（1）DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS

（2）3M NaAc

（3）TE：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA

（4）酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇（25:24:1）

（5）氯仿:異戊醇（24:1）

（6）異丙醇

（7）無水乙醇

（8）75%乙醇

（9）RNaseA

2.實驗步驟

（1）取真菌菌絲0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉

（2）加入4mL提取液，快速振蕩混勻

（3）加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇（24:1），渦旋3～5min（此處是粗提沒有加酚，可以節約成本）

（4）1000rpm，4℃，5min

（5）上清用氯仿:異戊醇（24:1）再抽提一次（10,000rpm，4℃離心5min）

（6）取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉淀, 混勻, 靜置約30 min

（7）用毛細玻棒挑出絮狀沉淀，用75%乙醇反復漂洗數次，再用無水乙醇漂洗1次，吹干，重懸于500ul TE中

（8）加入1ul RNaseA （10mg/mL），37℃處理1h

（9）用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇（25:24:1）和氯仿:異戊醇（24:1）各抽提1次（10,000rpm，4℃離心5min）

（10）取上清，1/10V 3M NaAc，2.5V體積的無水乙醇，-70℃沉淀30min以上

（11）沉淀用75%乙醇漂洗，風干，溶于200ul TE中，-20℃保存備用

二、真菌DNA的提取（方法二）

1.真菌菌絲0.5-1g，在液氮中迅速研磨成粉

2.加入3mL 65℃預熱的DNA提取緩沖液，快速振蕩混勻65℃水浴30min，期間混勻2-3次

3.加入1mL 5M KAc，冰浴20min

4.氯仿:異戊醇（24:1）抽提1次（10,000rpm，4℃離心5min）

5.取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇，混勻，靜置約30 min

6.用毛細玻棒挑出絮狀沉淀，用75%乙醇反復漂洗數次，再用無水乙醇漂洗1次，吹干，重懸于500ul TE中

7.加入1ul RNaseA（10mg/mL），37℃處理1h

8.用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇（25:24:1）和氯仿:異戊醇（24:1）各抽提1次（10,000rpm，4℃離心5min）

9.取上清，1/10V 3M NaAc，2.5V體積的無水乙醇，-70℃沉淀30min以上

10.沉淀用75%乙醇漂洗，風干，溶于200ul TE中，-20℃保存備用

DNA提取緩沖液：100mM Tris-HCl（pH8.0），20mM EDTA（pH8.0），1.5M NaCl，2% CTAB（W/V），4% PVP40（W/V）和2%巰基乙醇（V/V），PVP和巰基乙醇使用前加入5M KAc

方法一和二，是大同小異。主要是DNA提取液配方不一樣！成本也不一樣！
 

三、真菌菌絲的總RNA的提取

1.實驗試劑

（1）RNA提取緩沖液（CTAB）：2% CTAB（W/V），2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V），100mM Tris-HCl（pH8.0,DEPC處理的水配置），25mM EDTA，0.5g/L 亞精胺Spermidine，2.0M NaCl，2%巰基乙醇（V/V，使用前加入）。由于在高溫滅菌條件下，Tris-HCl要和DEPC發生反應，所以配RNA提取緩沖液時直接用DEPC處理的水配制即可

（2）SSTE：1 M NaCl，0.5% SDS（W/V），10mM Tris-HCl pH8.0，1.0mM EDTA

（3）10M LiCl 直接用蒸餾水配10M LiCl，加1‰的DEPC過夜后，高溫滅菌

（4）3M NaAc

（5）氯仿:異戊醇（24:1）

（6）酚（pH4.5）:氯仿:異戊醇（25:24:1）

（7）DEPC處理水 用1‰的DEPC處理蒸餾水過夜，高溫滅菌

（8）無水乙醇；70%酒精

2.實驗步驟

（1）實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱，離心管中加入ME（巰基乙醇），（10mL加80ul，50mL中加入300ul）

（2）取約0.8g菌絲體（液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了），在液氮中迅速磨成精細粉末，裝入50mL離心管，按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液，顛倒混勻

（3）65℃水浴3-10 min，期間混勻2-3次

（4）加入等體積的酚（注意是酸酚pH4.5）:氯仿:異戊醇（25:24:1）抽提（10,000rpm，4℃，5 min）

（5）取上清，等體積的氯仿:異戊醇（24:1）抽提（10,000rpm，4℃，5 min）

（6）加入1/4V體積10M LiCl溶液，4℃放置6h以上（或過夜）

（7）10,000rpm，4℃離心20min

（8）棄上清，用500ul SSTE溶解沉淀

（9）酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）抽提兩次，氯仿:異戊醇（24:1）抽提1次（10,000rpm，4℃，5min）

（10）加2V體積的無水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上

（11）12,000rpm，4℃離心20 min

（12）棄上清。沉淀用70%酒精漂洗一次，干燥

（13）加200ul的DEPC處理水溶解

（14）用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

（在抽提過程中，若蛋白質含量或其它的雜質還較多，可以增加抽提次數）

注意：提取RNA請盡量在低溫下操作，如果條件不容許，在室溫下操作的時間要盡可能的短。

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