簡(jiǎn)介
作為novel coronavirus免疫反應(yīng)的一部分，感染者體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生病毒特異性抗體，在出現(xiàn)癥狀后的一至三周內(nèi)，這些抗體可以在血液中被檢測(cè)到。IgG 和 IgM 幾乎同時(shí)出現(xiàn)，而 IgG 在更長時(shí)間內(nèi)維持一個(gè)高水平。在血清中，由于感染病毒或接種疫苗而產(chǎn)生的可檢測(cè)到的抗體可以防范將來被novel coronavirus感染。但這些抗體持續(xù)的時(shí)間長短和提供保護(hù)的程度是有關(guān)novel coronavirus仍需密切調(diào)查的眾多問題之一。

在人體血清中，通過免疫實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)novel coronavirus抗體是增進(jìn)我們了解 這種疾病以及疫苗研究的重要工具。Promega LumitTMDx SARS-CoV-2 免疫實(shí)驗(yàn)使用了帶有SmBiT 和 LgBiT ( 這是 NanoLuc 熒光素酶的兩個(gè)亞基，只有當(dāng)它們通過結(jié)合相互靠近時(shí)，才具有功能 ) 標(biāo)記的novel coronavirus刺突蛋白受體結(jié)合區(qū)域(RBD) 的一個(gè)片段。當(dāng)這些標(biāo)記過的病毒蛋白片段與含有novel coronavirus抗體的樣品一起孵育時(shí)，他們將與抗體結(jié)合，將 SmBiT和 LgBiT 兩個(gè)亞基結(jié)合到一起，并產(chǎn)生功能性的熒光素酶。添加 Lumit 檢測(cè)試劑，在微孔板光度計(jì)上測(cè)量產(chǎn)生的熒光信號(hào)。

Lumit 實(shí)驗(yàn)中，樣品的添加和測(cè)讀如圖 1 所示。沒有清洗的步驟并且一小時(shí)內(nèi)測(cè)得結(jié)果，使得這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以應(yīng)用于高通量篩選。SpectraMax iD5 多功能酶標(biāo)儀具有超冷光電倍增管(PMT)，可以為 Lumit Dx

novel coronavirus免疫實(shí)驗(yàn)提供高靈敏度的發(fā)光檢測(cè)。

優(yōu)點(diǎn)
• 放大高通量篩選，省去清洗步驟，

• 樣品體積僅需 15 微升，

• 一小時(shí)內(nèi)測(cè)得結(jié)果。

材料
• Lumit Dx novel coronavirus免疫實(shí)驗(yàn)試劑盒 (Promega cat. #VB1080)

•

novel coronavirus陽性血清樣品 (BioIVT cat. #HMSRM-COVID)

• 正常人血清 (Amsbio cat. #HSER-2mL)

• 白色 96 孔板 (Greiner cat. #655075)

• SpectraMax iD5 多功能酶標(biāo)儀 ( 美谷分子儀器 )

方法實(shí)驗(yàn)試劑的準(zhǔn)備和微孔板的操作如下 ( 更多的細(xì)節(jié)， 請(qǐng)參閱Lumit Dx novel coronavirus免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè) )：

1. 制 備 1x Lumit-Dx 免 疫 實(shí) 驗(yàn) 稀 釋 緩 沖 液 ( 添 加 5mL 10xLumit-Dx 免 疫 實(shí) 驗(yàn) 稀 釋 緩 沖 液 至 45 mL Lumit-Dx PBS/

EGTA 溶液中 )。

2. 來源于

novel coronavirus患者或健康受試者的 30 uL 血清樣本， 與 70 uL1x Lumit-Dx 免疫實(shí)驗(yàn)稀釋緩沖液混合。 有足夠的體積進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)； 通常每個(gè)孔僅需 15 uL 樣品。

3. Lumit-Dx CoV-2 BiTs Master Mix 現(xiàn) 配 現(xiàn) 用， 配 方 如 下：5mL 1x Lumit-Dx 免疫實(shí)驗(yàn)稀釋緩沖液、9.4 uL Lumit-DxCoV-2 LgBiT( 紅色蓋子 )、9.4 uL Lumit-Dx CoV-2 SmBiT( 藍(lán)色蓋子 )。添加完畢后，輕微地顛倒混勻。

4. Lumit-Dx 陽性對(duì)照、Lumit-Dx 陰性對(duì)照、Lumit-Dx 實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)試劑， 解凍后放置于室溫及時(shí)使用。簡(jiǎn)短的離心可使管壁內(nèi)容物甩至管底。

5. 按如下操作， 添加試劑至白色 96 孔板中：

• 每個(gè)孔加入 40uL Lumit CoV-2 BiTs Master Mix，

• 20uL 稀釋的病人血清樣本， 三個(gè)重復(fù)，

• 20uL Lumit-Dx 陽性對(duì)照，三個(gè)重復(fù)，

• 20uL Lumit-Dx 陰性對(duì)照，三個(gè)重復(fù)，

• 20uL Lumit-Dx 實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)試劑，三個(gè)重復(fù)，

6. 將微孔板封蓋，室溫孵育 20 分鐘。

7. 孵育后，制備 Lumit-Dx 檢測(cè)試劑 (7mL 1x Lumit-Dx 免疫實(shí)驗(yàn)稀釋緩沖液、230 uL Lumit-Dx 檢測(cè)底物 ( 灰色蓋子 )，現(xiàn)配現(xiàn)用。 輕微地顛倒混勻。

8. 60 uL 檢測(cè)試劑加入孔中，室溫孵育 3 分鐘。

9. 使用 SpectraMax iD5 讀板機(jī)測(cè)讀，如表 1 所設(shè)置。 測(cè)讀完成后，相對(duì)發(fā)光單位 (RLUs) 顯示在 SoftMax Pro 軟件的plate 板塊中。在模板中，這些孔被分配到不同的組中，各組產(chǎn)生的表單被用于計(jì)算和顯示數(shù)據(jù)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控按照試劑盒技術(shù)手冊(cè)進(jìn)行評(píng)估。 Lumit-Dx 實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)試劑、Lumit-Dx 陽性對(duì)照、Lumit-Dx 陰性對(duì)照都被用于確保最合適的實(shí)驗(yàn)性能。相比于 Lumit-Dx 實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)試劑，陽性對(duì)照必須產(chǎn)生更高的相對(duì)發(fā)光單位值，陰性對(duì)照必須產(chǎn)生更低的相對(duì)發(fā)光單位值。如果這些條件不滿足，微孔板測(cè)讀結(jié)果將是無效的。