來自麻省理工學(xué)院和杜克大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)一種可阻斷TLS途徑的小分子化合物并發(fā)表在CELL上。同時，用這種化合物和順鉑聯(lián)合治療體外腫瘤細(xì)胞和荷瘤小鼠時，都有顯著的效果。

這樣有臨床應(yīng)用潛力的明星分子是如何被發(fā)現(xiàn)的呢？

在哺乳動物細(xì)胞中，TLS的發(fā)生包括兩個步驟，首先插入TLS DNA聚合酶，如POL kPOL i、POL h或REV1，在損傷處引入一個核苷酸；接下來是募集b族聚合酶復(fù)合物POL z (POL z4: REV3L/REV7/POLD2/POLD3)進行3’端的延伸。而其中起主要作用的是約100個氨基酸的REV1 C-terminal domain (CTD)，它可以招募插入TLS的其他聚合酶POL k、POL i和POL h，并通過與REV7的相互作用來招募POL z。

基于此，作者首先分別構(gòu)建了His8-tagged REV7/3和FLAG-tagged POL k RIR-REV1 CTD表達系統(tǒng)并對融合蛋白進行純化，然后基于ELISA方法對化合物庫中高達~10000種化合物進行篩選，并將目標(biāo)鎖定了JH-RE-06。

然后作者采用高靈敏定量AlphaScreen技術(shù)，通過抗FLAG供體微珠、抗His受體微珠構(gòu)建勻相反應(yīng)體系，進一步確定了化合物JH-RE-06對REV1-REV7的阻斷作用，并得出了其IC50值為0.78 mM。

隨后，作者在分別在多種人類癌細(xì)胞和人類黑色素瘤小鼠模型上進行了驗證，證實此化合物可以提高癌細(xì)胞對順鉑類化合物的敏感性和長期化療的有效性，并對其他以DNA為作用靶標(biāo)的類似藥物，都有同樣的類似效果。

作者用清晰的思路論述了篩選和驗證化合物的過程，并進一步討論了化合物耐藥性機制：JH-RE-06能與Rev1結(jié)合并生成二聚體，而一旦形成這樣的二聚體結(jié)構(gòu)，則不能與Rev3 / Rev7 TLS DNA聚合酶結(jié)合，直接阻止了TLS的發(fā)生和癌細(xì)胞的快速復(fù)制，同時，也更進一步制止了突變產(chǎn)生的可能性，避免了癌細(xì)胞獲得耐藥性。

在整個實驗過程中，采用ALPHA技術(shù)對初篩得到的化合物JH-RE-06的功能驗證是非常重要的一步：

ALPHA的方法采用單體氧作為能量擴散的載體，其擴散距離可以達到200nm，發(fā)光原理為化學(xué)反應(yīng)發(fā)光，具有背景干凈、信噪比高的特點，同樣適合于復(fù)雜樣品的檢測，如組織液、血清、組織裂解液等，步驟少、方法簡單、均相反應(yīng)、不需要洗滌，因此實驗結(jié)果質(zhì)量更高。同時推薦選擇具有HTS ALPHA檢測模塊的多功能酶標(biāo)儀進行抗體的篩選，可以大大縮短檢測時間。

參考文獻

Jessica L. Wojtaszek, Nimrat Chatterjee, et al. ;(2019).A Small Molecule Targeting Mutagenic Translesion Synthesis Improves Chemotherapy. Cell. 178, 1–8,June 27