利用RNA編輯策略實(shí)現(xiàn)對逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的編輯干預(yù)

　　【儀表網(wǎng) 儀表研發(fā)】5月19日，Cell Discovery 在線發(fā)表了中國科學(xué)院上海巴斯德研究所研究員郝沛利用RNA編輯策略、編輯干預(yù)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的合作研究論文。該研究利用逆轉(zhuǎn)錄病毒/逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子生命周期中具有DNA和RNA兩個(gè)不同階段的特性，采用RNA編輯的策略，實(shí)現(xiàn)了對逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tf1(類似于逆轉(zhuǎn)錄病毒的模式生物)的編輯干預(yù)。同時(shí)，該工作還第一次采用CRISPR-Cas12a對逆轉(zhuǎn)錄病原體的DNA階段進(jìn)行編輯，達(dá)到了100%的編輯干預(yù)效率。
 

　　該研究開拓了對逆轉(zhuǎn)錄病原體(包括外源的逆轉(zhuǎn)錄病毒、內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子)進(jìn)行編輯干預(yù)的新思路。為RNA編輯和DNA編輯技術(shù)應(yīng)用于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染阻斷內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒失活和種質(zhì)資源培育中的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子抑制，提供了新的技術(shù)策略和并建立了系統(tǒng)參數(shù)。
 

　　逆轉(zhuǎn)錄子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
 

　　逆轉(zhuǎn)錄作用關(guān)鍵酶是逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶(IN)。逆轉(zhuǎn)錄子自身編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶。按結(jié)構(gòu)分：具有與逆轉(zhuǎn)錄病毒類似的長末端重復(fù)結(jié)構(gòu)(LIT)，并含gag和pol基因，但無被膜蛋白基因enu，不具有LTR但有3’polyA，其中心編碼區(qū)含有g(shù)ag和pol類似的序列，5’端常被截短。
 

　　另一方面，真核生物由于在核結(jié)構(gòu)，其轉(zhuǎn)錄和翻譯過程在時(shí)空上被分隔開與轉(zhuǎn)錄有關(guān)酶并非是由移動(dòng)因子編碼，而是由其他基因通過反式作用提供。
 

　　近年來，CRISPR系統(tǒng)開始發(fā)展成為對抗逆轉(zhuǎn)錄病原體(包括外源的逆轉(zhuǎn)錄病毒、內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子)非常有前途的重要技術(shù)。外源和內(nèi)源性的逆轉(zhuǎn)錄病毒是引發(fā)人體疾病的嚴(yán)重起因。導(dǎo)致疾病的著名外源和內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒包括HIV-1、HTLV-1、HERV-K等。前期科學(xué)家嘗試用CRISPR-Cas9編輯消除病人體內(nèi)的HIV-1，抑制豬體內(nèi)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(ERVs)，和消除水稻育種中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tos17的干擾，取得了一定的進(jìn)展。
 

　　RNA編輯(RNA editing)是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的加入、丟失或轉(zhuǎn)換等現(xiàn)象。RNA編輯產(chǎn)生的“基因”可稱為隱蔽基因( crytogene)，其產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)不能從基因組DNA序列中推導(dǎo)獲得。 早在1986年發(fā)現(xiàn)錐蟲線粒體mRNA轉(zhuǎn)錄加工后，其mRNA的多個(gè)編碼位置上加入或丟失尿苷酸。1990年在高等動(dòng)物和病毒中也發(fā)現(xiàn)了上述現(xiàn)象，在有些蛋白質(zhì)的表達(dá)過程中，發(fā)現(xiàn)有新的編碼序列產(chǎn)生或是編碼序列發(fā)生了改變，而且這種改變的發(fā)生不是在DNA水平上的，而是在RNA水平，通常會(huì)增加一些原來DNA模板中不曾編碼的堿基，這種現(xiàn)象是由RNA編輯所產(chǎn)生的。
 

　　雖然近年來發(fā)現(xiàn)的、專門靶向編輯RNA的 CRISPR第VI亞型 Cas13，為對逆轉(zhuǎn)錄病原體的編輯干預(yù)，提供了新的可能性和技術(shù)策略。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒/逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子生命周期中具有DNA和RNA兩個(gè)不同階段的特性，理論上RNA編輯的方法可以通過編輯RNA中間體，有效干預(yù)和對抗逆轉(zhuǎn)錄病原體，但這一技術(shù)策略迄今為止尚沒有被探索過。另外，近年來發(fā)現(xiàn)與CRISPR-Cas9類似、作用于DNA的CRISPR第V亞型Cas12a，具有一些優(yōu)秀特性，包括對PAM區(qū)的不同要求、自處理產(chǎn)生crRNA的能力和更高的靶向效率。但到目前為止尚沒有Cas12a應(yīng)用于編輯干預(yù)逆轉(zhuǎn)錄病原體的報(bào)道。本研究在以下幾個(gè)方面取得了新的進(jìn)展：
 

　　構(gòu)建了Tf1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座的報(bào)告系統(tǒng)。為了應(yīng)用RNA編輯(利用Cas13a)的技術(shù)策略和Cas12對逆轉(zhuǎn)錄病原體編輯干預(yù)，郝沛課題組與合作者首先構(gòu)建了Tf1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座的報(bào)告系統(tǒng)。他們在Tf1的NEO基因中引入了反向的內(nèi)含子(構(gòu)建多達(dá)4種不同的內(nèi)含子序列)，這樣Tf1轉(zhuǎn)錄剪接后新形成的Tf1產(chǎn)物將不具有這些引入的內(nèi)含子。然后通過設(shè)計(jì)crRNA，在實(shí)驗(yàn)中特異性靶向這些新形成的不包含內(nèi)含子的Tf1產(chǎn)物。
 

　　證明RNA編輯顯著干預(yù)抑制Tf1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座活性。郝沛課題組與合作者設(shè)計(jì)了Cas13靶向Tf1中間轉(zhuǎn)錄本的兩個(gè)特異位點(diǎn)和隨機(jī)對照的實(shí)驗(yàn)，獲得了對Tf1轉(zhuǎn)座活性的16%和60%的顯著編輯抑制效果。這些結(jié)果第一次證明了RNA編輯是對逆轉(zhuǎn)錄病原體有效的干預(yù)策略。更進(jìn)一步，對比Cas13a與靶標(biāo)結(jié)合被激活后(由于其亂切割活性)導(dǎo)致原核宿主細(xì)胞生長停滯的現(xiàn)象，研究者沒有觀察到Tf1在真核宿主中激活導(dǎo)致細(xì)胞停止生長的現(xiàn)象。這暗示了RNA編輯技術(shù)在真核宿主的安全性，也表明Cas13a在真核細(xì)胞與細(xì)菌細(xì)胞中的作用機(jī)制有所不同。
 

　　RNA編輯主要類型有：
 

　　①簡單編輯，單堿基轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)；
 

　　②插入編輯，插入單個(gè)核苷酸或少量核苷酸的丟失，其機(jī)制是轉(zhuǎn)錄鏈的跳格；
 

　　③泛編輯，插入或缺失多個(gè)尿嘧啶核苷酸或轉(zhuǎn)錄后插入多個(gè)胞嘧啶，其機(jī)制是編輯序列由外源反義引導(dǎo)RNA( gRNA)提供，gRNA在編輯體(editosome)核蛋白顆粒中與前編輯mRNA配對，鑒別作為錯(cuò)配的位點(diǎn)進(jìn)行編輯；
 

　　④多聚腺嘌呤編輯，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物末端加腺嘌呤，完善終止密碼子。
 

　　第一次采用CRISPR-Cas12a實(shí)現(xiàn)對逆轉(zhuǎn)錄病原體DNA階段進(jìn)行編輯干預(yù)。通過設(shè)計(jì)Cas12a靶向Tf1逆轉(zhuǎn)錄本的多個(gè)特異位點(diǎn)(5個(gè)crRNA設(shè)計(jì))和隨機(jī)對照的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Cas12a對Tf1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座的顯著編輯抑制作用(達(dá)到90%)——雖然仍有殘余的Tf1轉(zhuǎn)座發(fā)生。研究者猜測殘余的轉(zhuǎn)座活性，是由于Tf1中間產(chǎn)物被VLP包裝保護(hù)的結(jié)果。 所以更進(jìn)一步，通過延長crRNA的表達(dá)時(shí)間，終完全消除了殘余轉(zhuǎn)座活性，達(dá)到了100%的編輯干預(yù)效率。
 

　　這些研究成果，開拓了對逆轉(zhuǎn)錄病毒/逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子進(jìn)行編輯干預(yù)的新思路和新方法。比較了RNA編輯和DNA編輯的不同作用機(jī)制，完成了兩類機(jī)制對逆轉(zhuǎn)錄病原體復(fù)制和轉(zhuǎn)座的編輯干預(yù)效果的定量分析，為新技術(shù)策略發(fā)展建立了基礎(chǔ)并提供了系統(tǒng)參數(shù)。
 

　　資料來源：百科、上海巴斯德研究所